[發明專利]一種基于陽離子共軛聚合物和核酸酶輔助循環擴增的檢測目的核酸的方法

有效

• 申請號: 202010842154.0
• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN111850103B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 譚英;陳俊粵;譚春燕;金天
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6851;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

1.一種檢測目的核酸的方法，包括如下步驟：

（1）取含有核酸、反應緩沖液、DNA探針和核酸酶的反應體系，孵育；

（2）完成步驟（1）后，加入azo-PPE(+)，靜置5min以上；

（3）完成步驟（2）后，檢測熒光強度；

根據熒光強度判斷核酸中是否含有目的核酸或目的核酸的含量；

所述DNA探針與目的核酸的核苷酸序列相同或反向互補；

所述DNA探針的末端進行熒光標記；

所述核酸酶用于消化DNA探針和目的核酸形成的雙鏈核酸分子的一條核酸鏈，從而釋放另一條核酸鏈。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：當檢測N個目的核酸時，需要加入N個DNA探針且各個DNA探針的熒光標記完全不同；N為1以上的自然數。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

當核酸為DNA，核酸酶為DNA外切酶；所述DNA外切酶可以從雙鏈DNA分子的3’末端去除單個核苷酸，釋放ssDNA；

反應緩沖液為含8-12mM MgCl₂和0.8-1.2mM DTT的pH6.5-7.5、8-12mM Tris-HCl緩沖液。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于：

所述步驟（1）中，孵育為35-39℃孵育20-40min；

所述步驟（2）中，加入azo-PPE(+)后，azo-PPE(+)在體系中的濃度為3.4-3.8μM。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于：當核酸為miRNA時，反應體系還含有RRI。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于：

核酸酶為DSN；DSN可以消化RNA-DNA雜交雙鏈中的DNA鏈以釋放RNA；

反應緩沖液為含4-6mM MgCl₂和0.8-1.2mM DTT的pH7.5-8.5、40-60mM Tris-HCl緩沖液。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步驟（1）中，孵育為43-47℃孵育1-3h；

所述步驟（2）中，加入azo-PPE(+)后，azo-PPE(+)在體系中的濃度為2.8-3.2μM。

8.權利要求1至7任一所述的方法的應用，為a1）或a2）：

a1）區分核酸堿基差異；

a2）區分細胞或組織中核酸表達量差異。

9.azo-PPE(+)、與權利要求3或6中所述反應緩沖液和核酸酶組合的應用，為a1）或a2）或a3）：

a1）區分核酸堿基差異；

a2）區分細胞或組織中核酸表達量差異；

a3）檢測目的核酸。