本發明涉及一種基于微球輔助蛋白沉淀的藥物靶蛋白篩選方法。該方法對復雜生物樣品施加熱沉淀處理，藥物靶蛋白在可溶性部分中上調、在不可溶沉淀部分中下調的現象。在蛋白加熱沉淀過程中，加入微米尺寸大小的材料顆粒，使得變性的蛋白沉淀到微球表面，再在微球表面進行烷基化、酶解等蛋白質組學樣品前處理過程，再結合定量質譜技術，能夠實現快速高靈敏度高通量的藥物靶蛋白篩選。該方法建立在常規的熱穩定性藥物靶蛋白篩選方法之上，引入微球輔助蛋白沉淀這一策略，使得熱沉淀蛋白樣品更有利于后續的蛋白質組學分析，簡化樣品前處理過程，盡量避免樣品損失，降低所需求的初始樣品量，實現在次微克級別樣品中進行藥物靶蛋白篩選實驗。
技術領域
本發明屬于蛋白質組學研究方向藥物靶蛋白篩選方法領域，具體涉及通過微球輔助的蛋白質加熱沉淀來篩選藥物靶蛋白，與藥物小分子發生結合的靶蛋白的熱穩定性增強、不易因熱沉淀而沉積到微球表面，從而能將藥物靶蛋白從復雜的背景蛋白質組中區分出來。該方法操作簡便快速、高通量高靈敏度、可以在次微克級別樣品中進行藥物靶蛋白篩選。
背景技術
近年來，隨著蛋白質組學技術的發展，基于表型篩選的方法重新在新藥研發領域展現出優勢(文獻1：Lee,J.Bogyo,M.Target deconvolution techniques in modernphenotypic profiling.Current Opinion in Chemical Biology 17,118-126,doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.022(2013).；文獻2：Wagner,B.K.The resurgence ofphenotypic screening in drug discovery and development.Expert Opinion on DrugDiscovery 11,121-125,doi:10.1517/17460441.2016.1122589(2016).)。即使是在基于靶點的藥物發現模式占主流的21世紀早期，表型篩選仍然比基于靶點的篩選方法發現了更多的一線小分子藥物(文獻3：Swinney,D.C.Anthony,J.How were new medicinesdiscovered？Nature Reviews Drug Discovery 10,507-519,doi:10.1038/nrd3480(2011).)。因此，科學家們將目光重新投向傳統但有效的藥物表型篩選方法。盡管表型篩選是一種非常直觀有效的藥物篩選方法，它最大的瓶頸問題是無法直接指出待研究的藥物小分子的靶蛋白(文獻4：Heilker,R.,Lessel,U.Bischoff,D.The power of combiningphenotypic and target-focused drug discovery.Drug Discovery Today 24,526-532,doi:https://doi.org/10.1016/j.drudis.2018.10.009(2019).)。而藥物靶蛋白的發現，對于藥物的臨床應用有著很重要的意義，其參與了用藥指導、個性化治療策略、藥物副作用預測等多個臨床治療環節(文獻5：Ohki,Y.et al.Perturbation-Based ProteomicCorrelation Profiling as a Target Deconvolution Methodology.Cell ChemicalBiology 26,137-143.e138,doi:10.1016/j.chembiol.2018.10.012(2019).)。隨著基于質譜的蛋白質組學技術的飛速發展，藥物靶點篩選技術也被加速推進，近二十年來，多種基于蛋白質組學技術的藥物篩選方法已被開發出來。根據其工作原理，這些藥靶篩選方法大致可分為基于化學蛋白質組學的方法和無標記的方法。基于化學蛋白質組學的方法，顧名思義，需要在待研究的藥物小分子上進行化學改造，將藥物小分子固定在基質材料上或者在小分子化學結構上接枝一些可富集、可檢測的官能團，再通過一系列化學手段將藥物小分子及與之結合的靶蛋白富集出來并檢測(文獻6：Bantscheff,M.et al.Quantitativechemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinaseinhibitors.Nature Biotechnology 25,1035-1044,doi:10.1038/nbt1328(2007).文獻7：Barglow,K.T.Cravatt,B.F.Activity-based protein profiling for the functionalannotation of enzymes.Nature Methods 4,822-827,doi:10.1038/nmeth1092(2007).)。而無標記的藥物靶標篩選方法主要是通過檢測靶蛋白與藥物小分子結合后發生的結構和性質的改變，從而將靶蛋白從成千上萬的背景蛋白質中發掘出來(文獻8：Lyu,J.,Wang,K.Ye,M.Modification-free approaches to screen drug targets at proteomelevel.TrAC Trends in Analytical Chemistry 124,115574,doi:https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.06.024(2020).)。熱蛋白質組分析(Thermal protein profiling)是一種無標記的藥物靶標篩選方法，其通過研究藥物小分子配體的加入與否對靶蛋白的熱穩定性影響，從而發現藥物的靶蛋白(文獻9：Franken,H.et al.Thermal proteomeprofiling for unbiased identification of direct and indirect drug targetsusing multiplexed quantitative mass spectrometry.Nature Protocols 10,1567-1593,doi:10.1038/nprot.2015.101(2015).)。具體來說，蛋白受熱后會趨于解開其穩定結構并暴露出疏水腔形成沉淀，當靶蛋白與藥物小分子結合后其熱穩定性會增強，相比于未結合小分子的游離靶蛋白，溶液中靶蛋白-藥物復合物受熱后會更不易于生成沉淀。因此，熱蛋白質組分析通過研究加藥與否的條件下，觀測溶液中蛋白在一系列加溫度下發生沉淀的程度，通過描繪靶蛋白結合藥物后的熱穩定性偏移，從而發現藥物的靶蛋白。目前，熱蛋白質組分析方法已被成功應用于許多藥物靶蛋白、脫靶蛋白篩選實例之中(文獻10：Becher,I.et al.Thermal profiling reveals phenylalanine hydroxylase as an off-target of panobinostat.Nature Chemical Biology 12,908-910,doi:10.1038/nchembio.2185(2016).文獻11：Azimi,A.et al.Targeting CDK2 overcomes melanomaresistance against BRAF and Hsp90 inhibitors.Molecular Systems Biology 14,e7858,doi:10.15252/msb.20177858(2018).文獻12：Hashimoto,M.,Girardi,E.,Eichner,R.Superti-Furga,G.Detection of Chemical Engagement of Solute CarrierProteins by a Cellular Thermal Shift Assay.ACS Chemical Biology 13,1480-1486,doi:10.1021/acschembio.8b00270(2018).文獻13：Miettinen,T.P.et al.Thermalproteome profiling of breast cancer cells reveals proteasomal activation byCDK4/6inhibitor palbociclib.The EMBO Journal 37,e98359,doi:10.15252/embj.201798359(2018).)。
