[發(fā)明專利]一種微球輔助的基于蛋白加熱沉淀的藥物靶蛋白篩選方法

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• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN114076826A
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉明亮;呂佳紋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種微球輔助的基于蛋白加熱沉淀的藥物靶蛋白篩選方法，其特征在于：

1)對蛋白提取物樣品分別進(jìn)行加藥處理(加入待篩選靶蛋白的、待研究藥物)和空白處理(不加藥的處理)，于兩種處理的樣品組中分別加入微球材料，再對兩種處理的樣品分別都進(jìn)行加熱處理，使樣品中蛋白因加熱變性而沉淀；

2)將樣品中的微球材料取出，對加藥組和空白組中的蛋白豐度進(jìn)行定量分析；

通過加藥組與空白組之間的蛋白定量差異可以篩選出小分子藥物的靶蛋白；靶蛋白為空白組微球材料上的沉淀中豐度(沉淀量)大于加藥組沉淀中豐度的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

1)生物樣本在保持蛋白活性結(jié)構(gòu)的條件下進(jìn)行蛋白提取，測定提取液中的蛋白濃度，并調(diào)節(jié)蛋白濃度至0.5-2mg/mL；

2)使用分散溶劑溶解待研究的小分子藥物，小分子藥物終濃度1-10mM；將待分析的蛋白提取液等分為兩份，一份加入待研究的藥物(溶于分散溶劑的藥物)、另一份加入與加入藥物等體積的空白分散溶劑，然后孵育10～60分鐘；加入的藥物溶液或空白溶劑的體積比不超過蛋白提取液的10％，優(yōu)選0.5-2％；

3)于分別為20μL溶液的孵育完成的加藥和空白組蛋白溶液中分別加入等量的微球材料，投料量10-100μg將樣品進(jìn)行加熱處理，溫度區(qū)間在30～80攝氏度之間，在加熱處理下，蛋白從可溶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇艹恋聿⑶页练e到微球表面；此時，空白組微球材料上的藥物靶蛋白沉淀量大于加藥組；

4)分別將加藥組和空白組中表面有蛋白沉積的微球與含有未變性的可溶性蛋白的溶液分離，直接在微球表面上對通過微球輔助捕捉到蛋白沉淀進(jìn)行烷基化、酶解等蛋白質(zhì)組樣品前處理，通過基于質(zhì)譜的高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對加藥組和空白組中的蛋白豐度進(jìn)行定量分析；

通過比較沉淀樣品中，加藥組與空白組之間的蛋白質(zhì)豐度差異，能夠從廣泛的背景蛋白中鑒定到待研究藥物的靶蛋白；

或者，對于已知的需要驗證的蛋白可以使用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(WesternBlotting)，利用感興趣蛋白的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，通過比較加藥組與空白組之間的蛋白質(zhì)豐度差異，從而得知此蛋白是否為待研究藥物的靶點。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：

在保持蛋白活性結(jié)構(gòu)的條件下進(jìn)行蛋白提取的方法為液氮研磨組織、凍融破碎細(xì)胞等中的一種或二種以上；

所述的“保持蛋白活性結(jié)構(gòu)的條件”，對于組織樣品，可以采取液氮研磨的方式進(jìn)行蛋白提取，將組織在0-4℃條件下剪碎后加入液氮進(jìn)行研磨；對于細(xì)胞樣品，可以采用快速凍融法破碎細(xì)胞提取蛋白，向10⁴-10⁷細(xì)胞樣品中加入0-4℃預(yù)冷的0.2-1mL緩沖溶液并均勻分散細(xì)胞，將混合樣品投入液氮快速冷凍1-5分鐘，再投入25-37℃水浴融化1-5分鐘，使得樣品剛好從冰水混合物轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆诨癄顟B(tài)，注意不要過度加熱樣品；

無論經(jīng)過何種蛋白提取方式，蛋白提取液需通過10000-25000g高速離心，除去不溶解的組織、細(xì)胞碎片，保留含有活性蛋白質(zhì)的上清液。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述的“測定提取液中蛋白濃度”，可使用Bradford法或其他蛋白濃度測定方法；

緩沖鹽溶液為PBS、HEPES等不含有伯胺基團(tuán)的緩沖鹽溶液中的一種或二種以上

蛋白質(zhì)水解酶包括但不局限于胰蛋白酶、胃蛋白酶等中的一種或二種以上；

所述的“孵育完成的蛋白溶液(加藥或空白)”，指的是加入小分子藥物溶液或空白溶劑后孵育一段時間的蛋白溶液，其所孵育時間取決于小分子藥物與靶蛋白的親和力，為了加速二者結(jié)合，孵育過程通常在20-25℃條件下進(jìn)行，因此孵育時間通常不超過60分鐘(優(yōu)選30分鐘)以防止溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性改變；

所述的“微球材料”，指的是微米尺寸的球狀材料(直徑1-5μm)，多種表面性質(zhì)不同的微球材料都可以被應(yīng)用到本方法中，包括但不局限于C-18微球、光滑的鐵球、表面鍵合羧基的磁性微球等材料中的一種或二種以上；

分散溶劑為水、二甲基亞砜、緩沖鹽溶液、乙腈等劑中的一種或二種以上；

微球與溶液分離的分離手段包括但不局限于離心、磁力分離等中的一種或二種以上。