[發明專利]快速篩選新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體方法

在審

• 申請號: 202010839232.1
• 申請日: 2020-08-19
• 公開（公告）號: CN111925439A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 金艾順;韓曉建;王應明;胡超;李婷婷;王建為;李勝龍;申美瑩
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學;馮玉林
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85
• 代理公司: 重慶中流知識產權代理事務所(普通合伙) 50214
• 代理人: 胡長生

本發明屬于單克隆技術領域，具體公開了快速篩選新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體方法，包括以下步驟：S1?S3、采集新冠肺炎康復患者的外周血，分選RBD特異性記憶B細胞，采用RT?PCR擴增獲得抗體可變區cDNA；S4、采用巢式PCR擴增S1?S3得到的抗體可變區cDNA，構建抗體可變區基因表達盒；S5、將S4得到的抗體可變區基因表達盒轉導入細胞表達抗體并收集上清，篩選RBD特異性單克隆抗體；S6、將S5得到的RBD特異性抗體上清，檢測阻斷假病毒感染細胞活性，同時使用ELISA檢測上清阻斷RBD與ACE2結合能力，雙重方法檢測單克隆抗體中和能力，篩選RBD特異性中和性單克隆抗體。本發明能夠快速、高效獲得新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體。

技術領域

本發明屬于單克隆技術領域，尤其涉及快速篩選新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體方法。

背景技術

研究發現：新冠病毒(SARS-CoV-2)具有四種主要的結構蛋白，分別為刺突蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)，其中S蛋白有S1和S2兩個亞基，受體結合位點(RBD)位于S1亞基上，其主要功能是識別宿主細胞表面受體，介導SARS-CoV-2與宿主細胞的融合。

目前針對新發病原體COVID-19尚無特效藥物針對性治療，疫苗研發尚需時日。近期治愈出院的患者血漿中含有高濃度特異性的抗原中和抗體，輸入患者體內后，可以中和新冠病原體，介導有效的免疫反應，因此利用恢復期血漿有望為救治感染新冠病毒的患者提供有效的治療手段，降低死亡率，保障患者生命安全。

申請公開號為CN111303280A的中國發明專利申請公開了一種高中和活性抗SARS-CoV-2全人源單克隆抗體，該專利通過以下步驟篩選和制備單克隆抗體：(1)采用流式細胞儀分選單個被標記(CD3^neg/CD20^low/CD19^high/CD27^high/CD38^high)的漿細胞；(2)利用反轉錄-PCR和巢式-PCR技術擴增全人源單抗可變區基因；(3)構建線性表達框；(4)表達載體的構建和酶切鑒定；(5)單抗的瞬時表達和親和層析純化。

上述專利提供的是識別區域為S1非RBD區的全人源單克隆抗體，但是由于新冠病毒入侵宿主細胞是通過RBD與宿主細胞的ACE2結合，所以上述專利獲得的全人源單克隆抗體對病毒的阻斷效果有限，并且上述專利是通過標記漿細胞而獲得抗體cDNA，而漿細胞所引發的體液免疫反應有限。

發明內容

本發明的目的在于提供一種針對SARS-CoV-2的RBD受體結合位點，并且能夠引發更強烈體液免疫反應的快速篩選新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體方法。

為了達到上述目的，本發明的技術方案如下：

快速篩選新冠病毒RBD特異性全人源中和性單克隆抗體方法，包括以下步驟：

S1-S3、采集新冠肺炎康復患者的外周血，分選RBD特異性記憶B細胞，再通過RBD特異性記憶B細胞的mRNA獲得抗體可變區cDNA；

S4、采用巢式PCR擴增S1-S3得到的抗體可變區cDNA，構建抗體可變區基因表達盒；

S5、將S4得到的抗體可變區基因表達盒轉導入細胞表達抗體并收集上清，篩選RBD特異性單克隆抗體；

S6、將S5得到的RBD特異性抗體上清，檢測阻斷假病毒感染細胞活性，同時檢測上清阻斷RBD與ACE2結合能力，雙重方法檢測單克隆抗體中和能力，篩選RBD特異性中和性單克隆抗體。