[發(fā)明專利]一種動態(tài)檢測蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的探針及其制備方法與應(yīng)用

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• 申請日: 2020-08-19
• 公開（公告）號: CN111983238A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁凱;丹尼爾.范.阿爾頓;張耀文;王丹丹;陳芳;孟陽;張娜;廖瀟嘯
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 長沙智路知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43244
• 代理人: 謝珍貴

本公開涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種動態(tài)檢測蛋白質(zhì)O?GlcNAc糖基化的探針及其制備方法與應(yīng)用。所述探針包括N?乙酰氨基葡萄糖苷酶的失活突變體、蛋白標(biāo)簽和熒光分子標(biāo)記，該探針可在活體中對蛋白質(zhì)O?GlcNAc糖基化進行動態(tài)檢測和監(jiān)測的探針，在識別底物時序列偏好性較小，且不存在識別底物的傾向性問題，并具有高特異性、高靈敏度的特點。此外，本發(fā)明所提供的探針還具有低毒性的優(yōu)勢，在進行活體檢測時，不會對果蠅早期活胚胎的有絲分裂造成損傷。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種動態(tài)檢測蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的探針及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化是一種在蛋白質(zhì)絲、蘇氨酸殘基上連接單個N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的動態(tài)可逆的翻譯后修飾，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的水平由N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)兩種互相拮抗的酶共同維持，它們分別催化GlcNAc在蛋白質(zhì)上的添加和去除。這種修飾參與細胞眾多生物學(xué)過程。

目前已知的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化檢測方法包括凝集素檢測法、代謝標(biāo)記檢測法、酶標(biāo)記檢測法和抗體檢測法：

1、凝集素檢測法：小麥胚芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)是一種常見的植物凝集素，它不僅能與O-GlcNAc單結(jié)合，還能與末端含有N-乙酰氨基葡萄糖或殼聚糖的低聚糖結(jié)合。

2、代謝標(biāo)記檢測法：原理是將具有特殊修飾基團的GlcNAc類似物(如GlcNAz，GlcNAlk)引入細胞中，該類似物進入體內(nèi)代謝通路后將轉(zhuǎn)化成UDP-GlcNAc的類似物，最后以代謝方式將GlcNAc類似物傳遞到O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)中。GlcNAc類似物上還可以添加酮類、疊氮化物或巰基等基團，例如，利用疊氮化修飾的N-乙酰氨基葡萄糖(N-azido-acetylglucosamine，GlcNAz)對活細胞進行代謝標(biāo)記，由于GlcNAz也可以被轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物上，后續(xù)可以通過這個疊氮化物基團引入FLAG或者biotin等標(biāo)簽，從而用于O-GlcNAc糖基化底物的檢測和富集。

3、酶標(biāo)記檢測法：β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化含有酮類基團的半乳糖轉(zhuǎn)移到O-GlcNAc的羥基氧原子上，然后通過后續(xù)反應(yīng)使生物素特異地連接到酮類基團上，最后利用HRP標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin)抗體來識別生物素，從而達到富集和鑒定O-GlcNAc糖基化修飾的目的。

4、抗體檢測法：目前常用的商業(yè)化O-GlcNAc抗體有兩種：RL2和CTD110.6。RL2是針對核孔蛋白糖基化多肽序列制備的抗體，可以特異性地識別O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)；CTD110.6是針對RNA聚合酶II的C端結(jié)構(gòu)域糖基化多肽序列制備而來的IgG單克隆抗體，其肽段序列依賴性較小，所識別的O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)種類多。

然而，上述檢測方法卻各有各的缺陷：在凝集素檢測法中，WGA與O-GlcNAc單糖結(jié)合較弱，且在識別O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)時具有選擇性，更傾向于與核膜以及核孔中的組分結(jié)合；代謝標(biāo)記檢測法則需要進行多步反應(yīng)，局限性較大；酶標(biāo)記檢測法依賴于代謝標(biāo)記，且需要在體外進一步對O-GlcNAc進行修飾，期間并未考慮到細胞識別底物的傾向性問題；而抗體檢測法所使用的O-GlcNAc糖基化抗體對底物的識別有一定序列偏好性，不能用于活體檢測。

因此，亟需提供一種可用于活體檢測，并可對蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化進行動態(tài)監(jiān)測的試劑和方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種動態(tài)檢測蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的探針及其制備方法與應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：