[發明專利]一株雙色熒光蛋白標記鴨瘟病毒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010835946.5
• 申請日: 2020-08-19
• 公開（公告）號: CN113249340B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 陳柳;張存;倪征;華炯鋼;葉偉成;云濤;朱寅初
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/65;C12N15/63;C12N15/62;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一株雙色熒光蛋白標記鴨瘟病毒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）用mRFP-F1(gly)和mRFP-R1引物對從pLVX-mRFP-C1質粒上PCR擴增得到linker-mRFP，將所述linker-mRFP插入pMD19-T-simple載體中，篩選得到pT-linker-mRFP；

所述mRFP-F1(gly)的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述mRFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

2）用kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)引物對從pEP-kan-S質粒中PCR擴增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I- mRFP2的片段P1，利用Pst I酶切位點將所述片段P1克隆至所述pT-linker-mRFP，篩選正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1；

所述kan_RFP-for(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述kan_RFP-rev(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

3）用CFP-F1(gly-SacI)和CFP-R1引物對從pCMV-C-CFP質粒上PCR擴增得到linker-CFP，將所述linker-CFP插入pMD19-T-simple載體中，篩選得到pT-linker-CFP；

所述CFP-F1(gly-SacI)的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述CFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

4）用kan_CFP-for(Sac I)和kan_CFP-rev(Sac I)引物對從pEP-kan-S質粒上PCR擴增，得到含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的片段P2，利用Sac I酶切位點將所述片段P2克隆至所述pT-linker-CFP，得到pT-linker-CFP-P2；

所述kan_CFP-for(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述kan_CFP-rev(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

5）用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1)引物對從pT-linker-mRFP-P1模板PCR擴增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I- mRFP2序列的PCR產物，取所述PCR產物轉化至pDEV-dGFP/GS1783感受態細胞，通過Bgl II酶切篩選陽性克隆pDEV-kan.gCmRFP；

所述mRFP-gC(c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；

所述mRFP-gC(c)-R1)的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

所述pDEV-dGFP是從pDEV-EF1基因組刪除pEF1-GFP構建得到；

所述刪除pEF1-GFP所用引物為DEV-dEF1-gfp-for和DEV-dEF1-gfp-rev；所述DEV-dEF1-gfp-for的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述DEV-dEF1-gfp-rev的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

6）將所述pDEV-kan.gCmRFP導入大腸桿菌中，培養，誘導表達Ⅰ-SceⅠ核酸內切酶后孵育進行Red重組去除Kan基因，篩選陽性克隆pDEV- gCmRFP轉化至GS1783細胞中，制備感受態細胞，得到pDEV-gCmRFP /GS1783感受態細胞；

7）用CFP-UL35 (c)-F1和CFP-UL35 (c)-R1從pT-linker-CFP-P2上擴增含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I -CFP2的PCR產物，將所述PCR產物轉化至所述pDEV-gCmRFP /GS1783感受態細胞，篩選陽性克隆pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP；

所述CFP-UL35 (c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；

所述CFP-UL35 (c)-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示

8）將所述pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP導入大腸桿菌中培養，誘導表達Ⅰ-SceⅠ核酸內切酶后孵育進行Red重組去除Kan基因，篩選的陽性克隆pDEV- UL35CFP-gCmRFP進行拯救，得到雙色熒光蛋白標記鴨瘟病毒；

步驟1）~2）和步驟3）~4）之間沒有時間順序的限制。