[發明專利]基于分子信標的2019-nCoV核酸恒溫擴增引物和分子信標、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010830834.0
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN111826469A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 朱友杰;孔繁平
• 申請（專利權）人: 杭州昱鼎生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 常州易瑞智新專利代理事務所(普通合伙) 32338
• 代理人: 孫盼盼

1.一種引物和分子信標，其特征在于，檢測位點包含2019-nCoV病毒的ORF1ab基因及N基因，所述ORF1ab基因引物序列如ORF1ab-F(SEQ ID NO.1)和ORF1ab-R(SEQ ID NO.2)所示；所述N基因引物序列如N-F(SEQ ID NO.3)和N-R(SEQ ID NO.4)所示；所述ORF1ab基因分子信標探針如ORF1ab-P(SEQ ID NO.5)所示，所述N基因分子信標探針如N-P(SEQ ID NO.6)所示。

2.一種檢測2019-nCoV病毒的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的2019-nCoV病毒引物和分子信標。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含NASBA擴增緩沖液、NASBA酶混合液。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述NASBA擴增緩沖液包含Tris–HCl、MgCl₂、KCl、DTT、dNTP、NTP以及純水；所述NASBA酶混合液包含RNase H、T7-RNA聚合酶以及AMV反轉錄酶和純水。

5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述NASBA擴增緩沖液包含200mmol/LTris–HCl，60mmol/L MgCl₂，350mmol/L KCl，2.5mmol/L DTT，5mmol/L dNTP，10mmol/L NTP以及純水；所述NASBA酶混合液包含0.4U/μL RNase H，10U/μL T7-RNA聚合酶以及2U/μLAMV反轉錄酶和純水。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，當純水為500ml時，所述NASBA擴增緩沖液加入31.52g的Tris–HCl、5.71g的MgCl₂、26.09g的KCl、0.39g的DTT、50mL的100mM dNTP和100mL的100mM NTP；所述NASBA酶混合液的總體積為1ml時，其配比為8μl的50U/μL的RNaseH、200μl的50U/μL的T7-RNA聚合酶、400μl的5U/μL的AMV反轉錄酶以及添加純水至總體積為1ml。

7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，引物混合液包含50μM引物ORF1ab-F、50μM引物ORF1ab-R、50μM引物N-F、50μM引物N-R、50μM ORF1ab-P、50μM N-P。

8.一種利用權利要求3-7任意一項所述的試劑盒進行檢測2019-nCoV病毒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、制備NASBA擴增緩沖液：首先量取500ml純水，加入31.52g的Tris–HCl、5.71g的MgCl₂、26.09g的KCl、0.39g的DTT、50mL的100mM dNTP和100mL的100mM NTP；然后混勻后，加入純水定容至1L；

步驟二、制備NASBA酶混合液：加入8μl的50U/μL的RNase H、200μl的50U/μL的T7-RNA聚合酶、400μl的5U/μL的AMV反轉錄酶以及添加純水至總體積為1ml；

步驟三、制備引物混合液：基因引物混合液配制：取100μL 0.5mM的引物ORF1ab-F，100μL 0.5mM的引物ORF1ab-R，取100μL 0.5mM的引物N-F，100μL 0.5mM的引物N-R，取100μL分子信標探針ORF1ab-P，100μL分子信標探針N-P加入純水至總體積為1mL；

步驟四、制備RNA樣本：取一份待檢測的咽拭子RNA提取物作為RNA樣本；

步驟五、量取步驟一至步驟三制備的NASBA擴增緩沖液5μL、NASBA酶混合液5μL、引物混合液5μL與步驟四中的RNA樣本10μL充分混勻，將混勻后的混合液在42℃下反應30min；

步驟六、將步驟五中反應后的混合液加熱至85℃下孵育5min，之后在42℃孵育5min，即可使用熒光檢測儀完成檢測。