[發明專利]一種基于級聯反應檢測α-葡萄糖苷酶活性的普適性方法

在審

• 申請號: 202010828954.7
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN112014336A
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 陳傳霞;逯一中;倪朋娟;姜媛媛;張成會;王波
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/33;G01N21/78;G01N1/38
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 王翠翠

本發明提供一種基于級聯反應檢測α?葡萄糖苷酶活性的普適性方法，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，f?FeNC單原子納米酶能夠通過催化過氧化氫將無色的3,3',5,5'?四甲基聯苯胺氧化成顯藍色的3,3',5,5'?氧化態四甲基聯苯胺，催化顯色反應將檢測信號進行放大，在652 nm處產生紫外吸收峰，測試紫外光譜；葡萄糖濃度越高，溶液顏色越深，吸光度值越大，從而確定葡萄糖的含量，葡萄糖為α?葡萄糖苷酶底物的產物，從而確定α?葡萄糖苷酶的活性。納米酶催化的顯色反應放大了檢測信號，葡萄糖是各種α?葡萄糖苷酶底物的共有產物，比色法信號直觀、測試方便，因此該方法靈敏度高、普適性好且操作簡便。

一種基于級聯反應檢測α-葡萄糖苷酶活性的普適性方法

技術領域

本發明屬于生物分析檢測技術領域，具體是涉及一種基于級聯反應檢測α-葡萄糖苷酶活性的普適性方法，即一種利用納米酶參與的級聯反應進行α-葡萄糖苷酶活性測定的方法。

背景技術

α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，簡寫為α-Glu），是一種位于小腸黏膜刷狀緣的膜結合酶，能催化多糖或寡糖中α-吡喃葡萄糖苷鍵的特異性水解，進而產生葡萄糖，為人體提供能量物質。α-葡萄糖苷酶功能異常會導致代謝類疾病，如體內酸性α-葡萄糖苷酶缺乏，糖原不能正常代謝，會引發溶酶體貯積癥，即龐貝病；反之，α-葡萄糖苷酶活性過高會加速碳水化合物的吸收，引發餐后高血糖。因此，α-葡萄糖苷酶已經成為龐貝病篩選、糖尿病治療中最重要的生物標志物，并可用于篩選天然活性藥物。

現有的α-葡萄糖苷酶檢測方法主要有比色法、熒光法、電化學方法等，幾乎都是基于4-硝基苯酚、抗壞血酸等酶解產物進行檢測。多數方法靈敏度較低且底物專一，忽略了各種底物的共有產物-葡萄糖-在檢測中的應用。中國專利CN110823939A雖公開了一種利用1HNMR法檢測寡糖分解產生的葡萄糖來計算α-葡萄糖苷酶比活力值的方法，但儀器昂貴且需專業操作人員，多種氘代試劑的使用和冷凍離心等處理也增加危害性和操作難度。此外，已報道的方法常涉及多種納米材料的合成（Biosens. Bioelectron., 2016, 79, 728；CN108918478A）或材料的表面修飾（Sensor. Actuat. B-Chem., 2017, 245, 282），繁瑣耗時。因此，現有α-葡萄糖苷酶檢測技術在靈敏度、普適性和操作的簡便性方面仍有一定的缺陷。

經濟、簡便且靈敏的葡萄糖檢測方法對于開發可操作性強、普適性高且靈敏高效的α-葡萄糖苷酶測定技術是非常必要的。過氧化物酶法是最常用的葡萄糖檢測法，基于葡萄糖氧化酶（GOx）與過氧化物酶的級聯催化反應進行葡萄糖的檢測，靈敏度高且操作簡便。但天然酶穩定性差、價格昂貴。納米酶與天然酶相比，具有高穩定性和低成本等優勢，特別是具有極高催化效率和原子利用率的單原子納米酶，在檢測領域表現出巨大潛力。目前還未見α-葡萄糖苷酶、GOx及單原子納米酶的級聯催化反應在α-葡萄糖苷酶活性檢測中的相關報道。

發明內容

針對目前α-葡萄糖苷酶測定法大多靈敏度和普適性較差，且操作復雜的缺陷，我們發展了一種基于α-葡萄糖苷酶、GOx及單原子納米酶之間的級聯催化反應進行α-葡萄糖苷酶活性檢測的比色方法。納米酶催化的顯色反應放大了檢測信號，葡萄糖是各種α-葡萄糖苷酶底物的共有產物，比色法信號直觀、測試方便，因此該方法靈敏度高、普適性好且操作簡便。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種基于級聯反應檢測α-葡萄糖苷酶活性的普適性方法，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成過氧化氫，f-FeNC單原子納米酶能夠通過催化過氧化氫將無色的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺氧化成顯藍色的3,3',5,5'-氧化態四甲基聯苯胺，催化顯色反應將檢測信號進行放大，在652 nm處產生紫外吸收峰，測試紫外光譜；葡萄糖濃度越高，溶液顏色越深，吸光度值越大，從而確定葡萄糖的含量，葡萄糖為α-葡萄糖苷酶底物的產物，從而確定α-葡萄糖苷酶的活性。