[發明專利]重組抗RANKL抗體IgG2型的二硫鍵異構體及其純化方法

有效

• 申請號: 202010828720.2
• 申請日: 2020-08-18
• 公開（公告）號: CN111704670B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 梅菲;孫小偉;任杰;方鵬;陳坤;游猛;譚小釘
• 申請（專利權）人: 邁威（上海）生物科技股份有限公司;江蘇邁威康新藥研發有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K1/113
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本公開提供一種重組全人源抗RANKL單克隆抗體的純化方法，以含有重組人源抗RANKL單克隆抗體IgG2型的細胞培養上清液為對象，采用親和層析、低pH滅病毒、陰離子交換層析、陽離子交換層析、納濾除病毒、超濾濃縮等步驟進行純化。純化后的重組全人源抗RANKL單克隆抗體IgG2型拮抗RANKL的生物活性達到或超過現有技術的抗RANKL抗體。對于純化的重組全人源抗RANKL單克隆抗體IgG2型進一步通過由DTT和亞硫酸鈉構成的氧化還原體系處理，制備均一的重組全人源抗RANKL單克隆抗體IgG2型二硫鍵異構體。

技術領域

本發明屬于抗體工程領域，具體涉及一種重組人源抗RANKL抗體IgG2型的純化方法，特別是涉及一種重組抗RANKL抗體IgG2型的二硫鍵異構體及其純化方法。

背景技術

RANKL（receptor activator of NF-kB ligand，核因子κB受體活化因子配體）是破骨細胞維持其結構、功能和存活所必需的一種跨膜或可溶性的蛋白。人類 RANKL 的mRNA 主要在骨骼、骨髓以及淋巴組織中，在骨骼中的主要作用為刺激破骨細胞的分化和活性，抑制破骨細胞的凋亡。地諾單抗（denosumab,又稱AMC-162，商品名Prolia）是一種有獨特作用機制的骨吸收抑制劑，其特異性靶向RANKL，抑制破骨細胞活化和發展，減少骨吸收，增加骨密度。2010年5月28日，歐盟委員會批準地諾單抗（Denosumab）用于絕經后婦女骨質疏松癥和前列腺癌患者激素抑制相關骨丟失的治療，還用于目前其他治療方法無效或不能耐受的患者，以降低患者骨折的風險。2019年5月22日，NMPA有條件批準Denosumab（地諾單抗）上市，適應癥骨巨細胞瘤不可手術切除或者手術切除可能導致嚴重功能障礙的成人和骨骼發育成熟的青少年患者治療。我們前期已經開發了Denosumab的生物類似藥（Biosimilar）重組人源抗RANKL單克隆抗體注射液，其適應癥為治療絕經后婦女的骨質疏松和預防腫瘤骨轉移骨相關事件。所述重組全人源抗RANKL單克隆抗體，分子量為144.7kD，屬于IgG2型抗體。

四個IgG亞類的二硫鍵結構建立于20世紀60年代。這些二硫鍵結構被稱為經典的二硫鍵結構，因為它們被廣泛接受。然而，大量IgG分子的詳細表征揭示了重組和天然人IgG抗體中的幾種新結構特征。盡管半胱氨酸殘基應處于二硫鍵鍵合狀態，但已在IgG抗體的所有亞類中檢測到游離巰基。此外，二硫鍵易受化學修飾的影響，其可進一步產生結構變體，例如具有三硫鍵（trisulfide）或硫醚鍵（thioether）的IgG抗體。還觀察到所有亞類的IgG形成三硫鍵。通過β-消除降解二硫鍵產生游離巰基二硫化物和脫氫丙氨酸。游離巰基和脫氫丙氨酸之間的進一步反應導致形成不可還原的交聯物質。脫氫丙氨酸殘基的水解有助于抗體鉸鏈區（hinge region）的片段化。因此，這些二硫鍵變化對抗體結構，穩定性和生物學功能造成不期望的影響。

IgG2型分子重輕鏈是通過輕鏈的LC215同重鏈的HC136形成二硫鍵，兩條重鏈通過各自的HC224、HC225、HC228及HC231間形成四對二硫鍵而構成四聚體。由于空間位置接近，IgG2分子二硫鍵會發生重排，LC215可同HC224間形成二硫鍵而重鏈上的HC136則可同HC224或HC225間形成二硫鍵，如圖1所示。三種異構體分別命名為IgG2-A、IgG2-A/B及IgG2-B，其中IgG2-A/B為中間體。由于二硫鍵位置上的影響導致各異構體“壓縮”程度上存在差異，表現為表觀分子量上存在微弱的差異。抗體樣品非還原CGE分析可檢測到IgG2-A、IgG2-B兩個異構體。有文獻報道(Structural and Functional Characterization ofDisulfideIsoforms of the Human IgG2 Subclass THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY VOL. 283, NO. 23, pp. 16206–16215, June 6, 2008)IgG2亞型抗體的二硫鍵異構體在半胱氨酸/胱氨酸體系中二硫鍵會發生重排，從而促使異構體間互相轉變。在半胱氨酸/胱氨酸緩沖體系中，IgG2-A趨向于形成IgG2-B；當緩沖體系中加入適量的變性劑如鹽酸胍，IgG2-B趨向于形成IgG2-A。