[發明專利]CD29抗體在鑒定、分選人胎盤平滑絨毛膜源間充質干細胞中的應用

在審

• 申請號: 202010826698.8
• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN112063581A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 高雪華;孫雯;劉倩伶;曾焰;江蕊利;侯爽;海泉
• 申請（專利權）人: 成都清科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;G01N33/569
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 傅曉

1.CD29在鑒定、分選人胎盤平滑絨毛膜源間充質干細胞中的應用。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

S1：從人胎盤組織中分離并培養干細胞，將分離培養后的干細胞收集凍存，置于梯度凍存盒中，并于-80℃下降溫24h后轉入液氮中保存；

S2：復蘇一批上述凍存的干細胞，使細胞數量不低于2×10⁶個，離心清洗后分別使用CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD29、CD73、CD105抗體進行標記，并用PBS重懸到400μl，對重懸后的細胞用流式細胞儀進行檢測；挑選CD29、CD105、CD73表達量≥95％，且CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR表達量≤2％的干細胞，即為人胎盤平滑絨毛膜源間充質干細胞。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，人胎盤干細胞的分離包括以下步驟：

SS1：取健康足月的胎盤，剪取胎盤邊緣的胎膜組織，清洗后剝取平滑絨毛膜組織，剔除殘留血管；

SS2：將SS1得到的平滑絨毛膜組織剪成1mm³～3mm³的組織塊，加入組織清洗液，于700×g下離心清洗5min；

SS3：向清洗后的平滑絨毛膜組織中加入無血清培養基進行重懸，然后按6mg/cm²的接種密度接種至培養瓶，培養基體積與接種面積比為1:16，在37℃、5％CO₂以及飽和濕度條件下進行培養；培養過程中每隔3～4天更換一次培養基，直至P0代細胞融合度達到45％或非P0代細胞融合度達到80％；

SS4：向培養瓶中加入0.25％胰蛋白酶，對SS3所得細胞進行消化，接著用無血清培養基終止消化，消化完成后，將組織細胞懸液過100μm孔徑的篩網去除組織，在細胞懸液中加入0.9％氯化鈉注射液進行稀釋，500×g，離心清洗3min，然后加入無血清培養基重懸，調整密度為0.8×10⁴～1.4×10⁴個/cm²，接種至培養瓶中進行傳代培養；

SS5：待傳代后的細胞融合度達到85％時，加入0.25％胰蛋白酶對細胞進行消化，收集細胞，加入0.9％氯化鈉注射液進行稀釋，500×g，離心清洗3min，然后將預冷的細胞凍存液加入細胞中，重懸細胞使細胞密度為2×10⁶個/mL，然后以1mL/支分裝至凍存管中，放入梯度凍存盒，先在-80℃降溫24h后再轉入氣相液氮罐中保存，即得。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：鑒定、分選的人胎盤平滑絨毛膜源間充質干細胞的代次為P0～P3代。