[發(fā)明專利]用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針、試劑盒及方法和應用

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• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN111808996A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設計）人: 張若璇;徐國東;劉愈杰
• 申請（專利權）人: 武漢珈創(chuàng)生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 吳靜

本發(fā)明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種用于檢測多種Vesivirus的RT?PCR引物和探針、試劑盒及方法，包括用于檢測Vesivirus 2117、vesivirus strain CU/296/15/USA、Canine caliciviruses、Vesivirus Allston 2009/US、Vesivirus Allston 2008/US、Vesivirus Geel 2008/Belgium、Vesivirus W191R、vesivirus strain Bari/212/07/ITA的正向引物、反向引物和探針；其中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，且所述探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。本發(fā)明的引物和探針、試劑盒及方法可以同時檢測8種病毒，擴大了生物制品質量監(jiān)控的范圍，為預防和減少CHO生物制品中可能出現的外源因子的污染提供了技術支持，且具有簡單高效，靈敏度高、特異性強、高通量操作等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針、試劑盒及方法和應用。

背景技術

Vesivirus屬于杯狀病毒科，是一種無包膜的單股正鏈RNA病毒，具有傳染性。其RNA 5'-末端與VPg蛋白共價結合，3'-末端與poly(A)尾相連，被包裹在直徑約40nm的對稱二十面體衣殼內。Vesivirus基因組全長7.3–8.3kb，由3個主要的開放閱讀框(openreading frames,ORFs)，ORF1端編碼一段非結構蛋白，ORF2編碼一種衣殼前體蛋白，通過病毒蛋白酶的水解作用，生成成熟的衣殼蛋白，ORF3編碼一個小的結構蛋白VP2。

中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)作為表達復雜生物大分子蛋白的理想宿主細胞，已被廣泛用于重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等的研究開發(fā)和大規(guī)模生產。由于細胞系和其他原材料中可能攜帶病毒，或者由于操作不慎引入外源性病毒因子，在使用CHO細胞系生產生物制品時普遍存在外源病毒污染的風險。因此，中國藥典2020版明確規(guī)定生物制品和在生產生物制品的過程中使用的原材料需要經過嚴格的生物安全測試。

2003年，一家德國制藥公司偶然從CHO細胞培養(yǎng)中分離出來一種新的污染物，即杯狀病毒Vesivirus 2117。隨后又發(fā)生了三起重大的污染事故，2008年美國和比利時的藥廠在生產過程中分別發(fā)現污染物Vesivirus Allston 2008/US和Vesivirus Geel 2008/Belgium，被迫停廠整頓，次年生物巨頭美國健贊公司在其奧爾斯頓工廠生產線中檢測到一種病毒Vesivirus Allston 2009/US，致使其損失1-3億美元。因此，建立一種快速檢測Vesivirus病毒的方法，監(jiān)控CHO細胞系生物制品的生產過程，降低外源病毒污染的風險，顯得尤為重要。

實時定量熒光PCR(RT-PCR)Taqman探針法可對DNA/RNA進行定量，且具有靈敏度高、特異性強、準確度好、可自動化等優(yōu)勢，被廣泛用于病毒檢測、mRNA表達分析、SNP分析等多個領域。但是，現有的單管實時熒光定量PCR(RT-PCR)Taqman探針法通常只能檢測一種病原，因此，為了檢測多種類的病毒或同一種類病毒的不同病毒亞型或株，常常需要分別進行檢測，費時費力，因此，有必要設計一種簡單高效、靈敏度高、特異性強，并且能夠同時檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針、試劑盒及方法。

發(fā)明內容

為了克服上述現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針、試劑盒及方法和應用，具有簡單高效、靈敏度高、特異性強、高通量操作等優(yōu)點，可用于CHO細胞系主庫，相關原材料和生產過程中的質量監(jiān)測及早期預警。