[發明專利]用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針、試劑盒及方法和應用

在審

• 申請號: 202010826556.1
• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN111808996A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 張若璇;徐國東;劉愈杰
• 申請（專利權）人: 武漢珈創生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 吳靜

1.一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針，其特征在于：包括用于檢測Vesivirus 2117、vesivirus strain CU/296/15/USA、Canine caliciviruses、VesivirusAllston 2009/US、Vesivirus Allston 2008/US、Vesivirus Geel 2008/Belgium、Vesivirus W191R、vesivirus strain Bari/212/07/ITA的正向引物、反向引物和探針；其中，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，且所述探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。

2.如權利要求1所述的一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR引物和探針，其特征在于：所述報告熒光基團為FAM、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅熒光基團為BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

3.一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR試劑盒，其特征在于：包括如權利要求1或2所述的RT-PCR引物和探針。

4.如權利要求1所述的一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括定量質粒標準品，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.如權利要求4所述的一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括強陽性對照品、臨界陽性對照品和陰性對照品，所述強陽性對照品為1.0×10⁶copies/ul定量質粒標準品溶液，所述臨界陽性對照品為1.0×10⁰copies/ul定量質粒標準品溶液，所述陰性對照品由未感染Vesivirus的CHO細胞系混勻制備而成。

6.如權利要求3-5中任一項所述的一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括RNA提取液、逆轉錄酶反應液、RNA酶抑制劑RRI、逆轉錄酶、Taqman實時熒光定量PCR反應液。

7.如權利要求3-6中任一項所述的一種用于檢測多種Vesivirus的RT-PCR試劑盒在同時檢測Vesivirus 2117、vesivirus strain CU/296/15/USA、Canine caliciviruses、Vesivirus Allston 2009/US、Vesivirus Allston 2008/US、Vesivirus Geel2008/Belgium、Vesivirus W191R、vesivirus strain Bari/212/07/ITA中的應用。

8.一種定量檢測多種Vesivirus的RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取待測樣品RNA；

2)對提取的RNA進行逆轉錄，得到cDNA反應液。

3)將cDNA反應液與如權利要求1或2所述的RT-PCR引物和探針混合形成PCR反應體系，進行PCR反應，得到待測樣品中靶基因的Ct值，通過標準曲線換算得到待測樣品的起始拷貝數。