[發明專利]一種烯效唑單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202010825123.4
• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN112028998A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 郭嵐;萬益群;歐陽秋麗;何慶華;鄢愛平
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/53;G01N33/577
• 代理公司: 南昌青遠專利代理事務所(普通合伙) 36123
• 代理人: 唐棉棉

本發明提供了一種烯效唑單克隆抗體的制備方法，通過琥珀酸酐法合成人工半抗原烯效唑半琥珀酸酯，進一步采用碳二亞胺法將半抗原與牛血清蛋白偶聯得到烯效唑免疫抗原，對小鼠進行免疫，采用雜交瘤技術制備得到高度均質、純度高、專一性強的抗烯效唑單克隆抗體。本發明方法具有重復性好、易于標準化及可保證無限量供應等優勢。基于該單克隆抗體建立的間接競爭ELISA方法具有快速、廉價、簡便、靈敏、特異的優點，可便攜進行現場監測，克服了傳統檢測方法的缺點。且單抗可望進一步應用到免疫傳感器、膠體金免疫層析試紙條等技術的構建，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及單克隆抗體技術領域，具體的說，公開了一種烯效唑單克隆抗體的制備方法。

背景技術

烯效唑是20世紀80年代開發的一種三唑類的廣譜性植物生長延緩劑，兼有殺菌和除草作用，已被廣泛應用到農業和園藝領域中。從毒理學的角度來看，烯效唑可能會對人以及動物的內分泌有一定的副作用，此外烯效唑的光化學穩定性、低生物可降解性以及在環境中易轉移的特性使得它能夠在土壤中長期存在。因此，長期使用及濫用烯效唑可能會對人類健康造成影響。為此，許多國家和國際組織高度關注其安全性，陸續出臺了一些食品中該類植物生長調節劑的限量標準。如加拿大規定番茄中烯效唑的最大殘留量為0.01mg/kg；日本規定一些果蔬中烯效唑的最大殘留量為0.05-0.5mg/kg；我國食品安全國家標準GB2763-2019(食品中農藥最大殘留限量)則規定糙米中烯效唑最大殘留量為0.1mg/kg、小麥、花生仁和油菜籽均為0.05mg/kg。

目前，烯效唑的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等。這些分析方法重現性好，靈敏度高，但所需儀器設備昂貴，需要專業人員操作，而且操作過程繁瑣，分析速度慢，不適用于現場快速檢測。免疫分析法是以抗原與抗體的高度特異性結合反應為基礎，具有很高的特異性和靈敏度，而且樣品用量少、前處理簡單、檢測成本低，比較適用于大規模的現場樣品檢測，已在抗生素及其它化學殘留物的檢測方面得到了廣泛的應用。

發明內容

為了解決現有技術的這些不足之處，本發明提供一種烯效唑單克隆抗體的制備方法。

為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

一種烯效唑單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

S1.合成半抗原：在1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯的催化作用下，以無水吡啶為溶劑，烯效唑和琥珀酸酐發生酰化反應，引入活性基團羧基和連接臂，得到半抗原烯效唑半琥珀酸酯；

S2.合成免疫全抗原和檢測全抗原：采用碳二亞胺法將烯效唑半琥珀酸酯分別與牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA進行偶聯，得到免疫全抗原和檢測全抗原；

S3.免疫：用上述免疫全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全試劑與免疫全抗原充分乳化，腹部皮下多點注射，之后每隔4周加強免疫一次，加強免疫采用弗氏不完全試劑佐劑與抗原充分乳化，最后一次加強免疫通過腹腔注射40μg不加佐劑的抗原；

S4.篩選：測定小鼠血清效價和其特異性；

S5.細胞融合：選擇血清效價和特異性最優的小鼠取脾細胞與骨髓瘤細胞體外融合；

S6.雜交瘤細胞的篩選和陽性克隆的驗證：

選擇性培養基篩選融合細胞，檢測篩選陽性細胞，克隆化培養，進一步克隆篩選陽性細胞，陽性克隆擴培與凍存；

每天觀察雜交瘤細胞生長情況，約第十天，待雜交瘤細胞長至超過孔底面積的10％時，吸出120μL細胞培養液，進行抗體檢測篩選，并用新的2％HAT-LGDMEM+15％小牛血清細胞培養基補足每孔200μL；

采取間接ELISA與間接競爭ELISA篩選；

采用棋盤法，測定陽性血清的效價與半抑制濃度，選定篩選陽性克隆的包被濃度與標準品濃度；