[發(fā)明專利]一種烯效唑單克隆抗體的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010825123.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-17
• 公開（公告）號(hào): CN112028998A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭嵐;萬益群;歐陽秋麗;何慶華;鄢愛平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;G01N33/53;G01N33/577
• 代理公司: 南昌青遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 36123
• 代理人: 唐棉棉

1.一種烯效唑單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.合成半抗原：在1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯的催化作用下，以無水吡啶為溶劑，烯效唑和琥珀酸酐發(fā)生酰化反應(yīng)，引入活性基團(tuán)羧基和連接臂，得到半抗原烯效唑半琥珀酸酯；

S2.合成免疫全抗原和檢測(cè)全抗原：采用碳二亞胺法將烯效唑半琥珀酸酯分別與牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫全抗原和檢測(cè)全抗原；

S3.免疫：用上述免疫全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全試劑與免疫全抗原充分乳化，腹部皮下多點(diǎn)注射，之后每隔4周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全試劑佐劑與抗原充分乳化，最后一次加強(qiáng)免疫通過腹腔注射40 μg不加佐劑的抗原；

S4.篩選：測(cè)定小鼠血清效價(jià)和其特異性；

S5.細(xì)胞融合：選擇血清效價(jià)和特異性最優(yōu)的小鼠取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞體外融合；

S6.雜交瘤細(xì)胞的篩選和陽性克隆的驗(yàn)證：

選擇性培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，檢測(cè)篩選陽性細(xì)胞，克隆化培養(yǎng)，進(jìn)一步克隆篩選陽性細(xì)胞，陽性克隆擴(kuò)培與凍存；

每天觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，約第十天，待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至超過孔底面積的10%時(shí)，吸出120 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行抗體檢測(cè)篩選，并用新的2% HAT - LG DMEM + 15%小牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)足每孔200 μL；

采取間接ELISA與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選；

采用棋盤法，測(cè)定陽性血清的效價(jià)與半抑制濃度，選定篩選陽性克隆的包被濃度與標(biāo)準(zhǔn)品濃度；

S7.雜交瘤細(xì)胞的克隆化：

顯微鏡下觀察陽性孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)目，用移液槍輕輕吹打附著在孔壁的細(xì)胞，吸取的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入提前裝有小牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基的孔細(xì)胞板，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；利用梯度稀釋法對(duì)陽性細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆，兩天后，當(dāng)亞克隆板中出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，再吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，通過采取間接ELISA與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選陽性細(xì)胞與特異性強(qiáng)的細(xì)胞株，步驟同雜交瘤細(xì)胞的篩選和陽性克隆的驗(yàn)證；對(duì)于陽性非單克隆孔繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，直至篩選出效價(jià)高，且特異性強(qiáng)的單克隆細(xì)胞；每次亞克隆之前都要對(duì)篩選到的陽性細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)培，待培養(yǎng)液變黃后，吸取培養(yǎng)液，驗(yàn)證其效價(jià)與特異性，并適時(shí)進(jìn)行分裝擴(kuò)培；對(duì)篩選到的高效價(jià)且特異性強(qiáng)的單克隆細(xì)胞先轉(zhuǎn)至24孔進(jìn)行擴(kuò)培，驗(yàn)證其效價(jià)與特異性后，再轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；

S8.雜交瘤細(xì)胞的凍存：

待擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的80%，且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，細(xì)胞透亮，均勻一致時(shí)，于凍存前一日更換全部培養(yǎng)基，并再次通過間接ELISA與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA驗(yàn)證其效價(jià)與特異性；凍存前，將凍存液和凍存管置于4 ℃預(yù)冷2 h；用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹打下來，收集于10 mL離心管中，1000 rpm 離心8 min，棄上清；將沉淀的細(xì)胞用預(yù)冷的凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶ - 10⁷ 個(gè)/mL；每管1 mL分裝至細(xì)胞凍存管，標(biāo)明細(xì)胞名稱、批次、凍存日期等，于-20 ℃預(yù)凍1 h，而后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱冷凍過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐保存；

S9.單克隆抗體的大量制備：

取成年Balb/c 小鼠，于接種雜交瘤細(xì)胞前一周腹腔注射液體石蠟，每只注射0.5 mL；一周以后，將準(zhǔn)備好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射小鼠；腹水的產(chǎn)生需1-2周，期間密切觀察小鼠，若腹部明顯脹大，且腹部皮膚有緊張感，即可采集腹水；抽取腹水：測(cè)定腹水效價(jià)和 IC₅₀，分裝，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烯效唑單克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟S3中所述免疫過程具體為：從免疫全抗原免疫小鼠中選取八周±7天的雌性小鼠，免疫原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，100 μg/只的劑量對(duì)其進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，接下來每隔一個(gè)月±7天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，將免疫原與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，其中第二次免疫注射劑量為85 μg/只，第三次免疫注射劑量為60 μg/只，從第2次免疫后開始，每次加強(qiáng)免疫的前三天斷尾取血，檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性。