[發明專利]基于CRISPR和Cas的數字化核酸擴增檢測方法和集成化檢測系統

有效

• 申請號: 202010824712.0
• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN112029653B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 葉尊忠;吳翠;應義斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6851;B01L3/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發明公開了一種基于CRISPR/Cas的數字化核酸擴增檢測方法和集成化檢測系統。集成化檢測系統包括一個集成化反應芯片、溫度控制模塊、光源、光學信號檢測器；將核酸擴增體系均分成擴增微液滴，而后將數字化核酸擴增后的擴增微液滴和包含有CRISPR/Cas體系的檢測微液滴混合進行CRISPR反應，反應結束后，通過檢測光學信號實現目標物的高特異性檢測，并得到待測樣品中核酸分子的濃度或者拷貝數，實現目標物的高靈敏絕對定量檢測。本發明既具有數字化擴增技術絕對定量的特點，又具有CRISPR/Cas高靈敏、高特異性檢測的優點，將檢測過程集成在一個芯片上，簡化了操作步驟，同時避免了交叉污染等問題。

技術領域

本發明涉及核酸檢測微流控技術領域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas的數字化核酸擴增檢測方法和集成化檢測系統。

背景技術

自1999年Vogelstein等人提出數字聚合酶鏈式反應(digital Polymerase ChainReaction，dPCR)以來，已在食品安全、法醫鑒定、精準醫療等研究領域顯示出巨大的技術優勢和應用前景。dPCR是一種核酸分子絕對定量技術，通過將一個樣本分散成幾十到幾萬份至不同的反應單元，每個單元的核酸模板數少于或者等于1個；每個單元分別進行PCR擴增，擴增結束后有核酸模板的反應單元會發出熒光信號，沒有模板的反應單元沒有熒光信號，因此通過對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析得到核酸分子的數量。對于常規PCR和實時熒光PCR，其定量檢測都需要已知拷貝數的標準DNA制定標準曲線，然而由于樣品測定條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結果的準確性。而根據dPCR原理可知，該技術不會受標準曲線和擴增動力學影響，可以實現高靈敏度、高精準度、高耐受性的絕對定量。

由于PCR擴增技術需要對多個反應溫度進行精準控制，相關研究人員也提出了基于恒溫擴增技術的數字化恒溫核酸技術，例如基于環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的dLAMP、基于重組酶聚合酶擴增(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)的dRPA、基于多重鏈置換擴增(Multiple DisplacementAmplification，MDA)的dMDA等。

不論是dPCR還是數字化恒溫擴增技術，目前對于陰陽性反應單元的檢測大都基于熒光分析方法，通過在樣品中加入相應的熒光物質。基于核酸擴增的熒光分析法中的熒光物質主要有熒光染料、熒光探針：(1)熒光染料如SYBR系列染料、EvaGreen、FAM等；(2)熒光探針如Taqman探針。但是其中熒光染料不具有特異性，無法區分特異性擴增和非特異性擴增的產物。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規律成簇的具有規律間隔的短回文重復序列)，是大多數細菌及古細菌中一種不斷進化適應的免疫防御機制。CRISPR和Cas蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)協同作用，組成具有核酸切割能力的CRISPR/Cas系統。基于此，可以將CRISPR/Cas作為核酸檢測工具。例如，CRISPR/Cas12a系統可以根據設計的gRNA(guide Ribonucleic Acid)對目標鏈進行識別與捕獲，其DNA(Deoxyribonucleic Acid)酶切活性被激活，從而對體系中的單鏈熒光探針進行高效切割，實現目標DNA的特異性檢測。

目前，雖然CRISPR/Cas已經開始應用于核酸檢測中，但還未將其結合數字化核酸擴增一起使用。一方面是基于數字化核酸擴增技術的檢測系統往往需要液滴發生器、核酸擴增儀、液滴信號檢測儀等多臺儀器，集成度差，操作步驟比較繁瑣，仍在待完善階段；另一方面是由于核酸擴增技術的工作溫度(例如PCR技術中需要在95℃高溫時變性成單鏈)遠高于CRISPR/Cas體系中試劑的耐受溫度(一般為37℃)，若在擴增結束后再開蓋加入CRISPR/Cas體系會造成氣溶膠污染，對后續的檢測結果容易造成假陽性。