[發明專利]基于CRISPR和Cas的數字化核酸擴增檢測方法和集成化檢測系統

有效

• 申請號: 202010824712.0
• 申請日: 2020-08-17
• 公開（公告）號: CN112029653B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 葉尊忠;吳翠;應義斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12M1/38
• 分類號: C12M1/38;C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6851;B01L3/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種基于液滴式數字核酸擴增和CRISPR/Cas的集成化檢測系統，其特征在于：包含一個集成化反應芯片(3)、溫度控制模塊、光源、光學信號檢測器；所述集成化反應芯片(3)上分布有擴增體系液滴生成區(4)、核酸擴增區(6)、檢測體系液滴生成區(7)、液滴融合區(8)和光學檢測區(9)；擴增體系液滴生成區(4)與核酸擴增區(6)之間、核酸擴增區(6)與液滴融合區(8)之間、檢測體系液滴生成區(7)與液滴融合區(8)之間以及液滴融合區(8)與光學檢測區(9)之間均采用微通道(5)連通；光源與光學信號檢測器分別位于光學檢測區(9)的上下兩側，溫度控制模塊置于所述核酸擴增區(6)下方或上方，并對核酸擴增區(6)實現加熱；

所述的液滴融合區(8)為Y型或T型微通道，Y型或T型微通道的三端經各自的微通道(5)分別和核酸擴增區(6)、檢測體系液滴生成區(7)和光學檢測區(9)連通；

所述的微通道(5)的寬度為單個液滴的大小一致，使得只能單個液滴依次通過微通道(5)；

核酸擴增區(6)內含有核酸擴增體系的溶液，將核酸擴增體系的溶液生成擴增微液滴(12)；

檢測體系液滴生成區(7)內含有CRISPR/Cas體系的溶液，將CRISPR/Cas體系的溶液生成檢測微液滴(13)；

所述擴增微液滴(12)在核酸擴增區(6)完成擴增后和所述檢測微液滴(13)按固定流速進入液滴融合區(8)，利用液滴間的碰撞和聚合分別進行一個擴增微液滴(12)和一個檢測微液滴(13)的一一融合形成混合微液滴(14)，之后混合微液滴(14)進行CRISPR反應。

2.根據權利要求1所述的一種基于液滴式數字核酸擴增和CRISPR/Cas的集成化檢測系統，其特征在于：所述的集成化反應芯片(3)上設有快速連接結構(10)，溫度控制模塊通過快速連接結構(10)連接到所述集成化反應芯片(3)上的核酸擴增區(6)。

3.根據權利要求1所述的一種基于液滴式數字核酸擴增和CRISPR/Cas的集成化檢測系統，其特征在于：所述檢測體系液滴生成區(7)放置有一個降溫設備，或者在周圍布置冷卻通道(11)，冷卻通道(11)中加入冷卻液。

4.應用于權利要求1-3任一所述集成化檢測系統的一種基于CRISPR/Cas的非診斷目的的數字化核酸擴增檢測方法，其特征在于：將核酸擴增體系(1)的溶液均分成數以萬計的擴增微液滴(12)，再選擇工作環境實現擴增微液滴(12)內的核酸擴增；同時將CRISPR/Cas體系(2)的溶液均分成數以萬計的檢測微液滴(13)；將檢測微液滴(13)與擴增微液滴(12)分別一一進行融合，之后進行CRISPR反應，進而通過檢測光學信號實現目標物的高特異性檢測；

所述核酸擴增體系(1)的溶液進入通過擴增體系液滴生成區(4)均分成數以萬計的擴增微液滴(12)，通過溫度控制模塊對核酸擴增區(6)加熱；然后驅動擴增微液滴(12)經由微通道(5)按照固定流速進入核酸擴增區(6)，實現數字化核酸擴增；

CRISPR/Cas體系(2)的溶液在檢測體系液滴生成區(7)中均分成數以萬計的檢測微液滴(13)，其中檢測微液滴(13)包含有作為熒光探針的帶有熒光基團標記的單鏈寡核苷酸探針；

所述擴增微液滴(12)在核酸擴增區(6)完成擴增后和所述檢測微液滴(13)按固定流速進入液滴融合區(8)，利用液滴間的碰撞和聚合分別進行一個擴增微液滴(12)和一個檢測微液滴(13)的一一融合形成混合微液滴(14)，之后混合微液滴(14)進行CRISPR反應；

CRISPR反應完全后，混合微液滴(14)進入光學檢測區(9)，通過gRNA對混合微液滴(14)中的目標鏈進行識別與捕獲，DNA酶切活性被激活；若混合微液滴(14)中含有目標鏈，則熒光探針被切割，使得熒光基團和淬滅基團分離，在光源激發下發出熒光信號，通過光學信號檢測器分析單個混合微液滴(14)的熒光信號獲得陰性液滴和陽性液滴的比例，再計算核酸擴增體系中核酸分子的濃度或者拷貝數，從而獲得檢測結果。

5.根據權利要求4所述的一種基于CRISPR/Cas的非診斷目的的數字化核酸擴增檢測方法，其特征在于：方法對于陰性液滴和陽性液滴比例的獲得，采用以下兩種方式之一：

(A)混合微液滴(14)逐個檢測：

驅動混合微液滴(14)依次流過光學檢測區(9)，在光源激發或者沒有光源激發下，通過光學信號檢測器檢測光信號轉化為電信號，通過對電信號的波形進行濾波處理、去除基線、閾值劃分的處理得到陰性液滴和陽性液滴的比例p；

(B)所有微液滴同時檢測：所有混合微液滴(14)匯聚在光學檢測區(9)并分散排布，在光源激發或者沒有光源激發下，通過相機或者帶有拍照功能的手機對光學檢測區(9)進行拍照獲得光學圖像，通過感興趣區域獲取、濾波處理、閾值分割、計數的圖像處理得到陰性液滴和陽性液滴的比例p；

方法最后根據陰陽性液滴的比例p，按下述公式計算出每個混合微液滴(14)中的平均核酸分子數λ，從而獲得待測樣品中核酸分子的濃度或者拷貝數：

λ＝-ln(1-p)。