[發(fā)明專利]一種在三角褐指藻中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白用于自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010819737.1
• 申請(qǐng)日: 2020-08-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111893137B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范勇;丁曉婷;李福利;姜爾穎;師曉藝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/31;C12N1/13;C12P7/64;C12P17/02;C12R1/89
• 代理公司: 濟(jì)南竹森知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

本發(fā)明提供了一種在三角褐指藻中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白用于自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)的方法，主要通過(guò)VHb基因密碼子優(yōu)化及表達(dá)載體的構(gòu)建，構(gòu)建VHb表達(dá)載體，并將表達(dá)載體利用PCR擴(kuò)增線性化片段，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，篩選獲得轉(zhuǎn)基因藻株；本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因藻株，能夠不斷的提高該基因?qū)θ呛种冈逶谧责B(yǎng)和兼養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)效率和高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在三角褐指藻中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白用于自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

海洋微藻在海洋生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用，作為初級(jí)生產(chǎn)者，它們是海洋生物的重要食物來(lái)源。海洋微藻種類繁多，其中三角褐指藻由于其生長(zhǎng)速率快，油脂含量高等特點(diǎn)被人們所關(guān)注。其生長(zhǎng)速率可達(dá)到0.38g/L/d，收獲后油脂含量能達(dá)到48％以上，EPA(二十五碳烯酸)產(chǎn)率可達(dá)到36mg/L/d，近年來(lái)作為新的EPA生產(chǎn)來(lái)源。并且作為典型的硅藻，其巖藻黃質(zhì)含量在15.42～16.51mg/g之間。但藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中，易受到高光脅迫，產(chǎn)生過(guò)量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，造成細(xì)胞氧損傷，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，并影響不飽和脂肪酸的積累。因此，利用基因工程手段對(duì)野生型微藻進(jìn)行改造，提高其抗逆性，對(duì)改善三角褐指藻生長(zhǎng)，提高巖藻黃質(zhì)和EPA產(chǎn)量具有重要意義。

微藻的營(yíng)養(yǎng)方式具有多樣性，大多數(shù)微藻采用光合自養(yǎng)(Phetoautotrophy)方式，許多微藻具有利用有機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)(Mixotrophy)和異養(yǎng)(Heterotrophy)生長(zhǎng)的能力。自養(yǎng)的光限制因素嚴(yán)重制約了微藻生物量，兼養(yǎng)和異養(yǎng)能夠部分或全部消除光限制，成為提高微藻產(chǎn)量和胞內(nèi)活性物質(zhì)含量的有效途徑，因此微藻的兼養(yǎng)和異養(yǎng)研究成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外藻類生物學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

兼養(yǎng)是利用CO₂和有機(jī)碳，同時(shí)進(jìn)行光合作用和呼吸作用，因此在光限制條件下，大多數(shù)微藻的兼養(yǎng)比生長(zhǎng)速率約等于自養(yǎng)和異養(yǎng)比生長(zhǎng)速率之和，如：卡德藻(Tetraselmis sp.)、雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)和小球藻(Chlorellavulgaris)等。兼養(yǎng)為微藻高密度培養(yǎng)提供了一條有效途徑，兼養(yǎng)和異養(yǎng)有利于胞內(nèi)活性物質(zhì)的積累，對(duì)于開(kāi)發(fā)微藻生產(chǎn)胞內(nèi)活性物質(zhì)提供了很好的途徑。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)，發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性絲狀菌，是目前研究最為透徹，應(yīng)用最為廣泛，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能了解的最清楚的原核生物血紅蛋白。其主要存在形態(tài)有3種：氧化態(tài)、還原態(tài)和氧合態(tài)，三種形態(tài)之間可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。其中還原態(tài)是生理活性態(tài)，氧合態(tài)則是重要的穩(wěn)定狀態(tài)。還原狀態(tài)的血紅蛋白在577nm，544nm和420nm處有最大吸收峰。若向透明顫菌血紅蛋白氧合態(tài)細(xì)胞溶液中通入CO氣體，則絡(luò)合成復(fù)合物，在566nm，535nm和419nm呈現(xiàn)特征吸收峰。透明顫菌血紅蛋白的光譜吸收特性一般用來(lái)鑒定其在外源宿主中是否有表達(dá)活性。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103194459A(201310120495.7)公開(kāi)了一種高生物量和/或高葉黃素產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法，將透明顫菌血紅蛋白編碼基因?qū)胄∏蛟逯?，轉(zhuǎn)基因的小球藻生物量和葉黃素產(chǎn)量大于野生型。但是該專利中的小球藻是一類能夠天然進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵的微藻，使用透明顫菌血紅蛋白的目的類似于微生物發(fā)酵中的作用，使得氧氣能夠更好地供給細(xì)胞，提高有機(jī)物的利用效率。本發(fā)明專利中使用的海洋微藻為非天然異養(yǎng)微藻，三角褐指藻無(wú)法高效的在異養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，僅能一定程度上進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)，提高兼養(yǎng)效率是提高三角褐指藻生物量和巖藻黃質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)鍵，不同于以上專利，本發(fā)明專利中使用透明顫菌血紅蛋白主要用于提高海洋微藻的兼養(yǎng)效率和降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧損傷，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因藻種的生產(chǎn)效率，與現(xiàn)有公開(kāi)專利的發(fā)明原理不同，解決的技術(shù)問(wèn)題不同。

發(fā)明內(nèi)容