[發明專利]一種在三角褐指藻中表達透明顫菌血紅蛋白用于自養和兼養培養的方法

有效

• 申請號: 202010819737.1
• 申請日: 2020-08-14
• 公開（公告）號: CN111893137B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 范勇;丁曉婷;李福利;姜爾穎;師曉藝
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/31;C12N1/13;C12P7/64;C12P17/02;C12R1/89
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.一種在三角褐指藻中表達透明顫菌血紅蛋白轉基因藻株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）VHb基因密碼子優化及表達載體的構建

對原VHb基因如SEQ ID NO.1所示，進行藻類偏好性密碼子優化，優化后的VHb基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列與原氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示；以pPha-T1為基礎表達載體，在fcp-A啟動子下游插入優化后的VHb基因，構建VHb表達載體，即質粒pPha-fcp-VHb；

（2）轉化株的制備

將步驟（1）構建的表達載體利用PCR擴增線性化片段，通過電轉化的方式導入細胞內，篩選獲得表達透明顫菌血紅蛋白的轉基因藻株。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）中將質粒pPha-T1作為模板，利用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，PCR擴增構建載體所需的骨架片段；以含有優化后的VHb基因片段的質粒載體為模板，利用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7擴增優化后的VHb基因片段。

3.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述PCR反應體系如下：

DNA模板 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×pfu mix 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL；

PCR反應條件如下：

94 °C預變性 5 min；94 °C變性 30 s，引物Tm值-5 °C退火 30 s，72 °C延伸 2000bp/min，重復35個循環；72 °C延伸 10 min。

4.如權利要求3所述的構建方法，其特征在于，基于優化后的VHb片段與載體骨架之間的重疊區域，用無縫連接酶試劑盒進行連接，構建質粒pPha-fcp-VHb。

5.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（2）中利用引物SEQ ID NO.8和SEQID NO.11擴增共表達優化后的VHb基因與抗性基因的線性片段，用于電轉化獲取單拷貝轉化株。

6.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，將宿主藻細胞在f/2液體培養基中培養至對數生長期，離心濃縮收集（3~5）×10⁸個細胞；用375 mM的山梨醇洗3~5次后，向藻液中加入3~5 μg 優化后的VHb基因與抗性基因的線性片段，混勻后置于冰上反應10~60分鐘；將反應后的藻液加入電轉杯中，在2200~3600 V，600~1000 Ω，50~100 μF條件下進行電擊；電擊后的藻液立即轉移至10 mL新鮮的f/2培養基中，避光復蘇48小時；復蘇后的藻液離心5分鐘，棄上清，重懸于適量新鮮培養基中，涂布于含有博來霉素抗性的f/2抗性平板上，于光照培養箱中培養，待6~12周后挑選轉化子；

利用試劑盒對轉化株進行基因組提取后，通過PCR對單拷貝轉化株進行擴增驗證，獲得單拷貝轉化藻株。

7.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟（2）中利用引物SEQ ID NO.8和SEQID NO.9擴增優化后的VHb表達元件，引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11擴增抗性標簽元件，用于電轉獲取多拷貝轉化株。