[發明專利]一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法

在審

• 申請號: 202010816658.5
• 申請日: 2020-08-14
• 公開（公告）號: CN112063547A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 陳齊;鄭建豐;馬章獻;韓迪;宋錦安
• 申請（專利權）人: 潤盈生物工程（上海）有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/04;C12R1/225
• 代理公司: 上海專益專利代理事務所(特殊普通合伙) 31381
• 代理人: 方燕娜;王雯婷

1.一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：按照如下步驟進行：

步驟1：將蝦粉及DB7801分別用水浸泡，浸泡2小時后，105℃條件下沸騰30分鐘，于6000rpm，8min離心，取上清液待用；

步驟2：配制MRSA培養基；

步驟3：在250mL平底瓶中裝200mL MRSA培養基，接種保存的格氏乳桿菌 LG-G12甘油管，后置于37℃恒溫培養箱中靜置培養12小時，再轉接2%至另一個新鮮的200mL MRSA培養基中，后置于37℃恒溫培養箱中靜置培養6至8小時，得到格氏乳桿菌 LG-G12種子液；

步驟4：利用步驟1完成的上清液及蝦粉，配制發酵培養基；

步驟5：在250mL平底瓶中裝200mL發酵培養基，接種2%步驟3所得的格氏乳桿菌LG-G12種子液，置于37℃恒溫培養箱中靜置培養12小時，檢測OD₆₀₀、pH及發酵液活菌數；

步驟6：根據步驟5的檢測數據優化培養基配方：配制另一發酵培養基放入發酵罐中進行發酵培養，在另一發酵培養基的基礎上，添加5g/L的碳酸鈣，培養基裝量為4L，起始培養基pH為7.2，滅菌消毒條件為溫度121℃、時間25分鐘，降溫至36~38℃，以2~3％的接種量接入格氏乳桿菌 LG-G12種子液，保持溫度37℃，攪拌轉速80rpm，并且通入氮氣維持發酵罐壓力在0.03MPa，期間檢測發酵液在600nm波長處的吸光值及pH值，待pH值不下降或降到4.4左右時，停止發酵，取樣離心，得到菌泥；

步驟7：配制一種或一種以上的保護劑，將保護劑進行滅菌處理，條件為溫度115℃、15分鐘，滅菌后迅速降溫至10~20℃待用；

步驟8：按照菌泥：保護劑為1:2的比例進行乳化及真空冷凍干燥，得到格氏乳桿菌LG-G12凍干菌粉；

步驟9：格氏乳桿菌LG-G12凍干菌粉分別貯存在37℃、25℃、4℃與-18℃環境中，于0天、1周、2周、3周、1月、2月與3月分別取樣檢測MRSA培養基中的活菌數，檢測凍干菌粉活菌數變化。

2.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：所述的MRSA培養基包括：葡萄糖20 g/L，牛肉浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫-80 1 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，硫酸錳0.05 g/L。

3.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：所述的發酵培養基包括：葡萄糖20 g/L，牛肉浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫-80 1 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，硫酸錳0.05 g/L，半胱胺酸鹽2 g/L，蝦粉0~5g/L，蝦粉上清液0~10g/L，發酵用大豆蛋白粉DB7801上清液0~10g/L。

4.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：步驟6中所述的離心條件為溫度4℃，轉速8000rpm，離心時間8min。

5.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于: 步驟7中所述的保護劑配方包括：海藻糖8~14%，蔗糖4~8%，糊精2~8%，葡萄糖1~4%，果膠1~4%，水73%。

6.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：步驟8中所述的真空冷凍干燥的條件為：首先在溫度-80℃條件下預凍6h，后在冷阱溫度低于-57℃、真空度0.1Pa條件下，冷凍干燥25~32小時。

7.根據權利要求1所述的一種格氏乳桿菌LG-G12高密度發酵及提高菌粉質量的方法，其特征在于：所述的格氏乳桿菌LG-G12（Lactobacillus gasseri LG-G12），保藏地點為：中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M2019829，保藏時間為2019年10月17日。