[發(fā)明專利]一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010815280.7
• 申請日: 2020-08-14
• 公開（公告）號: CN111821317A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙江濤;花育旗;陳斌
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇中衍生科細(xì)胞技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/19;A61K47/26;A61P17/00;A61P17/18;C12N5/0775
• 代理公司: 南京禾易知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 王彩君

本發(fā)明公開了一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法及應(yīng)用，包括胎盤蛻膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞上清液收集、間充質(zhì)干細(xì)胞因子的純化、間充質(zhì)干細(xì)胞因子凍干粉制備。本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞。避免了FBS中的成分對皮膚的刺激。此外，在低氧的條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，刺激細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子。通過低溫凍干技術(shù)，使產(chǎn)品可在常溫下保存，方便運輸，且有延長分泌因子活性保存期限。得到的胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凍干粉，能通過煥活衰老細(xì)胞來達(dá)到肌膚抗皺、美白、抗氧化、淡化痘印等多重功效。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSC因其具有多向分化潛能、促進(jìn)造血干細(xì)胞歸巢、修復(fù)損傷或病變的組織器官、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等功能。MSC最初發(fā)現(xiàn)在骨髓中，胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率低，且無社會倫理爭議等方面的有點，使其具有更好的應(yīng)用前景。

隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入，其作用機理越來越清晰明確，主要有二方面：一、間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。二、間充質(zhì)干細(xì)胞替代或修復(fù)死亡或受損的組織細(xì)胞。越來越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌上百種細(xì)胞活性因子，如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF-BB)白介素6(IL-6)等。這些細(xì)胞因子通過直接或間接地參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)過程，能夠促進(jìn)血管形成、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝、加速傷口愈合，修復(fù)細(xì)胞損傷、促進(jìn)膠原蛋白合成、緩解細(xì)胞衰老等，因此市場上急需一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法及應(yīng)用來解決這些問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法及應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的目前市面上的油茶籽油營養(yǎng)價值不夠高的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種人胎盤蛻膜間干細(xì)胞分泌因子凍干粉制備方法，包括以下步驟：

步驟1：取足月健康的新生兒胎盤，置于含無菌保存液的儲運盒中，待分離制備；

步驟2：將羊膜去除，將胎膜全部剪下，放置培養(yǎng)皿中，用0.9％氯化鈉注射液清洗2-3次，直至無明顯血液，從胎膜上分離蛻膜組織，分離下來的蛻膜組織收集于離心管中，加入適量0.9％氯化鈉注射液，離心洗滌1-2遍。棄上清，剪碎成1-4mm³大小的組織塊；

步驟3：加入膠原酶消化1.5h；

步驟4：消化使用輸血器濾網(wǎng)將消化后的混合液馬上過濾，組織塊需要洗滌1-2次；

步驟5：細(xì)胞濾液離心后，用移液管輕輕吸取去掉上清；

步驟6：加入適量完全培養(yǎng)基吹打后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶水平放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

步驟7：原代培養(yǎng)24-48h后，進(jìn)行第一次全量換液。此后每隔3天全量換液，放置培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

步驟8：將收集的濃縮原液用0.22um濾器過濾除菌，加入終濃度5％甘露醇，2％海藻糖，2％右旋糖苷，調(diào)節(jié)蛋白溶度至1mg/ml，混勻；

步驟9：按照2.5ml/支分裝到無菌、無熱源7ml西林瓶中，在潔凈環(huán)境下，凍干30小時，凍干結(jié)束后，真空壓蓋，去除西林瓶，制備得到胎盤蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子凍干粉。