[發明專利]一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉制備方法及應用

在審

• 申請號: 202010815280.7
• 申請日: 2020-08-14
• 公開（公告）號: CN111821317A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 趙江濤;花育旗;陳斌
• 申請（專利權）人: 江蘇中衍生科細胞技術研究院有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/19;A61K47/26;A61P17/00;A61P17/18;C12N5/0775
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 王彩君

1.一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：取足月健康的新生兒胎盤，置于含無菌保存液的儲運盒中，待分離制備；

步驟2：將羊膜去除，將胎膜全部剪下，放置培養皿中，用0.9％氯化鈉注射液清洗2-3次，直至無明顯血液，從胎膜上分離蛻膜組織，分離下來的蛻膜組織收集于離心管中，加入適量0.9％氯化鈉注射液，離心洗滌1-2遍。棄上清，剪碎成1-4mm³大小的組織塊；

步驟3：加入膠原酶消化1.5h；

步驟4：消化使用輸血器濾網將消化后的混合液馬上過濾，組織塊需要洗滌1-2次；

步驟5：細胞濾液離心后，用移液管輕輕吸取去掉上清；

步驟6：加入適量完全培養基吹打后轉入培養瓶，培養瓶水平放入37℃，5％CO2培養箱中培養；

步驟7：原代培養24-48h后，進行第一次全量換液。此后每隔3天全量換液，放置培養箱進行培養。

步驟8：將收集的濃縮原液用0.22um濾器過濾除菌，加入終濃度5％甘露醇，2％海藻糖，2％右旋糖苷，調節蛋白溶度至1mg/ml，混勻；

步驟9：按照2.5ml/支分裝到無菌、無熱源7ml西林瓶中，在潔凈環境下，凍干30小時，凍干結束后，真空壓蓋，去除西林瓶，制備得到胎盤蛻膜間充質干細胞分泌因子凍干粉。

2.根據權利要求1所述的一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉制備方法，其特征在于，所述儲運液為150ml的DMEM；II型膠原酶為2mg/ml；無血清培養液為5％血清替代物和無酚紅無血清培養基。

3.根據權利要求1所述的一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉制備方法，其特征在于，所述胎盤蛻膜間充質干細胞選用P4、P5代的細胞，將檢測合格的細胞按6-7*104/ml(以活細胞計)的濃度轉至細胞工廠，做好標記(日期、代次)，置37℃，5％CO2，5％O2陪養箱中進行低氧培養。經過72h培養，細胞融合度達到85％-95％時，收集細胞上清液。

4.根據權利要求1所述的一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉制備方法，其特征在于，所述胎盤蛻膜間充質干細胞分泌因子的分離純化；將收集的細胞上清液放入離心管中，4℃離心，3000g離心10分鐘，取上清液，出去沉淀物，將去沉淀物后的上清液轉移至5KD超濾濃縮離心管中，將上清液體積濃縮至一半體積。

5.根據權利要求1所述的一種人胎盤蛻膜間干細胞分泌因子凍干粉的應用，其特征在于，所述該凍干粉能夠促進血管形成、促進細胞新陳代謝、加速傷口愈合，修復細胞損傷、促進膠原蛋白合成、緩解細胞衰老。