[發明專利]一種脫細胞人源角膜基質的制備方法

在審

• 申請號: 202010815050.0
• 申請日: 2020-08-13
• 公開（公告）號: CN111840644A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 郭文廣;蔡楓;蘇萍;肖丹;許偉;吳佳宇
• 申請（專利權）人: 鎮江雷音再生醫學科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36
• 代理公司: 南京創略知識產權代理事務所(普通合伙) 32358
• 代理人: 呂娟

本發明公開一種脫細胞人源角膜基質的制備方法，包括1）細胞前處理：使用含1％（V/V）青霉素?鏈霉素?兩性霉素B(100×三抗)混合溶液的緩沖液沖洗，有效殺滅細菌和真菌，防止污染；2）細胞破碎處理：采用滲透壓沖擊法破碎細胞，細胞溶脹破裂同時能夠很好地保持角膜基質的組織生理結構及膠原纖維的形態；3）酶消化處理：采用核酸酶處理有效的去除細胞的DNA和RNA成分，脫細胞處理安全徹底；4）漂洗與修復：清洗角膜細胞殘留同時對角膜膠原纖維具有保護作用，促進角膜創口的自我修復；5）滅菌。本發明制備方法，脫細胞完全，對角膜基質膠原無損傷，可最大程度保護角膜基質的生物學特性并有效地去除基質細胞。

技術領域

本發明涉及一種脫細胞人源角膜基質的制備方法。

背景技術

中國角膜病致盲者約500萬左右，僅次于白內障，居眼科致盲疾病的第二位，約80％的患者可通過角膜移植來避免致盲。但我國由于受到傳統觀念和眼庫條件的限制，角膜捐獻者數量很有限，治療成本昂貴。近代組織工程角膜研究的興起和發展為尋找角膜替代材料開辟了另一個方向，隨后也出現了合成材料和天然生物材料的角膜替代物，這些材料雖然具有良好的生物相容性，移植后可維持眼球的完整，并能在一定程度上恢復角膜的透明度，但由于其缺少天然角膜的結構，依然存在很多不足，例如透明度不高，移植后降解過快，生物力學強度較差，不能耐受縫線切割等，使其臨床應用較為局限。隨著科研的發展，近年來人們將焦點集中在天然的動物角膜材料。利用脫細胞的方法去除異種角膜的外源細胞及抗原物質，從而獲得異種無細胞的角膜細胞外基質材料，應用于人角膜疾病的治療。但異種動物來源角膜在臨床使用上仍存在一些難以規避的問題，例如人和動物之間存在著種族差異，如果細胞脫除不徹底，將產生強烈的免疫排斥反應。

自2011年，隨著全飛秒激光角膜屈光手術的發展和普及，角膜基質透鏡這一手術“副產品”的出現為我們構建組織工程角膜基質提供了新的選擇。據不完全統計我國每年完成的手術約100萬例以上，在手術中角膜基質透鏡被完整地取出，產生了龐大數量的角膜透鏡“副產品”，從而引發學者們近幾年致力于“變廢為寶”對透鏡再利用的研究，結果表明取下的角膜透鏡可以重新應用于多種角膜疾病的治療，這無疑為拓寬角膜移植供體來源、緩解角膜供體不足又提供了新方法。

來源于全飛秒激光手術，與動物角膜基質相比優勢在于同種異體來源，組織結構更為相似，生物相容性及生物安全性好，且來源廣泛、取材方便。然而，盡管角膜是免疫赦免組織，但同種異體角膜基質移植仍有可能發生免疫排斥反應，且研究發現供體中殘留的細胞成分會影響供體與受體的整合，可能會導致免疫排斥反應，因此也需要進行脫細胞處理。現有的脫細胞處理方法對角膜基質的破壞性大。在脫細胞過程中反復凍融或超聲破碎細胞極易對角膜微觀結構產生破壞，造成膠原斷裂，損傷角膜基質的張力，影響角膜基質的光學性能和力學性能，從而導致移植后透明度恢復不好，影響患者視力；而且一些脫細胞方法中加入了表面活性劑等化學試劑，后期處理不好會有較大的毒性殘留。這些因素都決定角膜材料在臨床上能否成功移植，影響手術效果。

發明內容

針對上述存在的問題，本發明提供一種脫細胞人源角膜基質的制備方法，該脫細胞處理方法采用滲透壓破碎細胞，并采用核酸酶處理去除細胞的DNA成分，相對于動物角膜的脫細胞處理要更為安全溫和有效，避免了反復凍融和高靜壓超聲破碎細胞以及表面活性劑的加入帶來的弊端。具體技術方案如下：

一種脫細胞人源角膜基質的制備方法，包括步驟如下：

1）脫細胞前處理：將來源于全飛秒激光屈光矯正手術的人角膜基質材料置于配制好的洗滌液中清洗，進行脫細胞前處理；

2）細胞破碎處理：采用滲透壓沖擊法使人角膜基質材料上殘留細胞的細胞膜和核膜破裂，釋放出其含有的核酸物質，包括DNA和RNA成分；

3）酶消化處理：采用DNA酶和RNA酶的聯合作用，去除細胞破裂釋放的DNA及RNA成分；