[發明專利]一種脫細胞人源角膜基質的制備方法在審
| 申請號： | 202010815050.0 | 申請日： | 2020-08-13 |
| 公開（公告）號： | CN111840644A | 公開（公告）日： | 2020-10-30 |
| 發明（設計）人： | 郭文廣;蔡楓;蘇萍;肖丹;許偉;吳佳宇 | 申請（專利權）人： | 鎮江雷音再生醫學科技有限公司 |
| 主分類號： | A61L27/36 | 分類號： | A61L27/36 |
| 代理公司： | 南京創略知識產權代理事務所(普通合伙) 32358 | 代理人： | 呂娟 |
| 地址： | 212000 江蘇省鎮江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 細胞 角膜 基質 制備 方法 | ||
1.一種脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：包括步驟如下：
1）脫細胞前處理：將來源于全飛秒激光屈光矯正手術的人角膜基質材料置于配制好的洗滌液中清洗，進行脫細胞前處理；
2）細胞破碎處理：采用滲透壓沖擊法使人角膜基質材料上殘留細胞的細胞膜和核膜破裂，釋放出其含有的DNA和RNA成分；
3）酶消化處理：采用DNA酶和RNA酶的聯合作用，去除細胞破裂釋放的DNA及RNA成分；
4）漂洗與修復：采用配制好的修復液對人角膜基質材料進行漂洗，清除破碎細胞的殘留組織同時修復人角膜基質材料的創口；
5）滅菌：采用鈷-60或電子束輻照對人角膜基質材料進行滅菌處理，從而完成制備，獲得脫細胞人源角膜基質。
2.根據權利要求1所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：步驟1）中，所述脫細胞前處理，人角膜基質材料于洗滌液中清洗的次數為2～3次；沖洗時間為每次1～3min。
3.根據權利要求2所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：所述洗滌液為含1％體積分數的青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液的PBS或HBSS緩沖液。
4.根據權利要求1所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：步驟2）中，所述滲透壓沖擊法為高滲液-低滲液沖擊法，即將人角膜基質材料先置于高滲液中，浸泡2～6h，待細胞內外滲透壓達到平衡后移入低滲液中浸泡3～5h，使細胞快速溶脹，細胞膜和核膜破裂。
5.根據權利要求4所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：所述高滲液為1.5mol/L的NaCl溶液；所述低滲液為三蒸水。
6.根據權利要求1所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：步驟3）中，所述酶消化處理為使用含有DNA酶和RNA酶的PBS或HBSS緩沖液進行處理，處理的溫度為25～35℃，處理時間為1h。
7.根據權利要求6所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：所述緩沖液中DNA酶和RNA酶的濃度均為500～1000U/ml。
8.根據權利要求1所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：步驟4）中，所述漂洗與修復，漂洗的次數為2～3次，漂洗時間為每次2～5h。
9.根據權利要求8所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：所述漂洗修復所用修復液的溶劑為三蒸水，修復液的組分中含有0.8～2%（重量）的透明質酸、1.0～2.5%（重量）的硫酸軟骨素和0.5～2.5%（重量）的低分子量右旋糖酐。
10.根據權利要求1所述的脫細胞人源角膜基質的制備方法，其特征在于：步驟5）中，所述滅菌，采用鈷-60或電子束輻照的劑量為15～25kGy。
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