[發明專利]一種雞顯性白快速基因分型檢測方法

在審

• 申請號: 202010809931.1
• 申請日: 2020-08-12
• 公開（公告）號: CN111893193A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 劉繼強
• 申請（專利權）人: 北京康普森農業科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858
• 代理公司: 天津垠坤知識產權代理有限公司 12248
• 代理人: 王忠瑋

1.一種雞顯性白快速基因分型檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：

S1:根據顯性白基因PMEL17及PMEL17基因外顯子10上的9bp插入位點設計引物，所述引物包括以下3種引物：

核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物；

S2:建立PCR體系；

S3：進行PCR擴增，94℃預變性15min，94℃變性20s,55-61℃退火和延伸60s,進行10個循環；94℃變性20s，55℃退火和延伸60s，進行26個循環；94℃變性20s，57℃退火和延伸60s，進行3個循環；

S4：進行數據掃描得到顯性白控制基因的分型結果。

2.根據權利要求1所述的雞顯性白快速基因分型檢測方法，其特征在于，步驟S2中，建立的PCR體系中的DNA來自雞的血液，其中，雞血液中的DNA獲取方法如下：

S21：先向離心管中加入Proteinase K，之后再加入血液；

S22：向離心管中加入Buffer ML，渦旋振蕩5秒鐘使其充分混勻后，將離心管放于56℃水浴鍋中孵育15分鐘，期間渦旋震蕩混勻2次；

S23：將離心管從水浴鍋中取出，短暫離心后室溫放置5分鐘，加入徹底混勻的異丙醇與Magbeads混合物，渦旋震蕩混勻5秒鐘后將離心管放于25℃、1600rpm的恒溫混勻儀上震蕩混勻5分鐘或將離心管連續顛倒混勻10分鐘；

S24：將離心管放于磁力架上靜置1分鐘，待Magbeads完全吸附于離心管側壁后徹底棄去溶液，過程中需保持離心管固定于磁力架上；

S25：將離心管從磁力架上取下，加入無水乙醇，加入Buffer GW1后渦旋點震1分鐘或渦旋振蕩5秒鐘后放于25℃、1600rpm的恒溫混勻儀上震蕩混勻2分鐘，之后將離心管放于磁力架上靜置1分鐘，待Magbeads完全吸附于離心管側壁后輕輕顛倒磁力架將離心管蓋上的雜質洗落后棄去溶液；

S26：重復步驟S25；

S27：將離心管從磁力架上取下，加入無水乙醇，加入Buffer GW2后渦旋點震1分鐘或渦旋振蕩5秒鐘后放于25℃、1600rpm的恒溫混勻儀上震蕩混勻2分鐘，之后將離心管放于磁力架上靜置1分鐘，待Magbeads完全吸附于離心管側壁后顛倒磁力架，將離心管蓋上的雜質洗落后徹底棄去溶液；

S28：重復步驟S27；

S29：保持離心管固定于磁力架上，用移液器進一步去除離心管管底和管蓋上的溶液，之后室溫放置5—10分鐘，使乙醇完全揮發；

S210：將離心管從磁力架上取下，加入Buffer EB，渦旋震蕩使磁珠完全懸浮于洗脫液中后將其放于56℃、1600rpm的恒溫混勻儀上震蕩洗脫10分鐘，或將離心管放于56℃水浴鍋中孵育10分鐘，期間每隔3分鐘渦旋震蕩10秒鐘；

S211：將離心管放于磁力架上靜置2分鐘，待Magbeads完全吸附于離心管側壁后用移液器將洗脫液轉移至新的離心管中-20℃保存備用。

3.根據權利要求2所述的雞顯性白快速基因分型檢測方法，其特征在于：步驟S29中，如果離心管側壁上有液珠，則向離心管中加入無水乙醇，蓋蓋后顛倒離心管，同時保持離心管固定于磁力架上，之后徹底棄去無水乙醇。

4.根據權利要求1所述的雞顯性白快速基因分型檢測方法，其特征在于：所述PCR體系包括所述3種引物、DNA以及KASP Master Mix的混合物。