[發明專利]一種印跡脂肪酶及其合成蔗糖-6-乙酯的應用

有效

• 申請號: 202010809917.1
• 申請日: 2020-08-13
• 公開（公告）號: CN112029754B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 錢俊青;趙長燕;茍李紅
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/082
• 分類號: C12N11/082;C12P19/12
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種印跡脂肪酶及其合成蔗糖?6?乙酯的應用，所述印跡脂肪酶按如下方法制備：向脂肪酶酶液中，加入脂肪酸、糖醇，攪拌使其混合均勻，調節混合酶液pH為6.5?8.5，在20?30℃恒溫下，以120?160轉/分鐘的速度攪拌10?25分鐘后，立刻加入大孔樹脂，在25?35℃恒溫、60?100轉/分鐘下攪拌吸附3?6h，過濾，獲得濾液和濾餅；濾餅用蒸餾水洗滌后，真空干燥，獲得印跡脂肪酶；本發明以糖醇輔助，10?18碳鏈脂肪酸為印跡分子在水相中印跡脂肪酶，明顯提高了印跡酶在有機溶劑中催化酯化的性能，蔗糖酯化率可以提高10％左右，蔗糖酯的六位酯化率可以提高近10％。

技術領域

本發明涉及一種印跡脂肪酶及其合成蔗糖-6-乙酯的應用。

背景技術

脂肪酶具有良好的催化酯化性能，在醫藥、食品產業有廣泛的用途。以底物或底物類似物印跡脂肪酶，提高酶的催化酯化效果，是當前脂肪酶研究的熱點技術，并取得了一定的進展。根據已公開報道的印跡技術，采用有機酸或酯類化合物作為印跡分子開展脂肪酶印跡，在水配制的緩沖液中采用乙醇為印跡物的助溶劑，以表面活性劑乳化，完成脂肪酶印跡，可以一定程度改變脂肪酶空間構型，從而提高脂肪酶催化性能。

發明內容

本發明目的是提供一種印跡效果明顯提高的脂肪酶印跡方法，在水配制的緩沖液中以脂肪酸作為印跡化合物，加入糖醇輔助，可明顯提高對脂肪酶的印跡效果，較現有國內外脂肪酶的印跡技術均有優勢。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種印跡脂肪酶，所述印跡脂肪酶按如下方法制備：將脂肪酶溶解在pH為6.5-8.5緩沖液中，超聲助溶（優選300W功率超聲5分鐘），使脂肪酶充分溶解，有不溶成分則過濾去除，得到脂肪酶酶液；向脂肪酶酶液中，加入脂肪酸、糖醇，攪拌使其混合均勻，調節混合酶液pH為6.5-8.5（優選用0.01M的NaOH水溶液或0.05M的磷酸水溶液調節），在20-30℃恒溫下，以120-160轉/分鐘的速度攪拌10-25分鐘后，立刻加入大孔樹脂，在25-35℃恒溫、60-100轉/分鐘下攪拌吸附3-6h，過濾，獲得濾液和濾餅；濾餅用蒸餾水洗滌后，真空干燥，獲得印跡脂肪酶；所述脂肪酸為C10-C18脂肪酸，優選為下列之一：油酸、癸酸、棕櫚酸、硬脂酸、月桂酸；所述糖醇為下列之一：山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇。

所述緩沖液優選為0.05mol/L、pH7.5的磷酸鈉緩沖液，所述緩沖液體積用量以脂肪酶重量計為40-100ml/g，優選45-85 ml/g；所述脂肪酶酶液中脂肪酶與脂肪酸重量比為1：2- 4.5（優選1:3-3.5）；所述脂肪酶酶液中脂肪酶與糖醇重量比為1：8-23（優選1:13-17）。

所述大孔樹脂的型號為下列之一：D4006、D3520、D1300；所述大孔樹脂添加量與脂肪酶酶液中脂肪酶重量比為20~55：1。所述大孔樹脂在加入前先進行預處理，所述預處理方法為：將大孔樹脂置于燒杯中，加入體積濃度95%乙醇水溶液，于室溫（25-30℃）、150r/min的條件下震蕩洗滌24小時，并于中途兩次更換體積濃度95%乙醇水溶液，震蕩結束后，每次用300ml蒸餾水洗滌五次，抽濾，濾液蒸餾回收乙醇，濾餅即為預處理后的大孔樹脂；所述體積濃度95%乙醇水溶液體積用量以大孔樹脂重量計為10ml/g。

本發明還提供一種所述印跡脂肪酶在催化蔗糖合成蔗糖-6-乙酯中的應用，所述的應用方法為：將蔗糖、印跡脂肪酶、4A分子篩加入叔戊醇與二甲基亞砜復配的溶劑中，再加入乙酸乙烯酯，混勻，40℃和180 r/min條件下振蕩反應16h后，反應液在4000r/min離心10min，取上層清液在真空度0.1個標準大氣壓下80℃回收溶劑，獲得蔗糖-6-乙酯。

所述蔗糖與乙酸乙烯酯的質量之比為1:2.5；所述蔗糖與印跡脂肪酶重量比為1：9.7；所述蔗糖與4A分子篩重量比為1：9.7；所述叔戊醇、二甲基亞砜體積用量以蔗糖重量計分別為77.7ml/g和19.4ml/g。所述4A分子篩使用1前先在180℃干燥6小時。