[發(fā)明專利]一種改進(jìn)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜人血清中15種膽汁酸的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010799383.9
• 申請(qǐng)日: 2020-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN112098532A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬金飛;楊青青;孔子清;劉華芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州凱萊譜精準(zhǔn)醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 杭州宇信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33231
• 代理人: 李學(xué)紅

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種改進(jìn)的人血清中15種膽汁酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括蛋白質(zhì)沉淀、樣品稀釋、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析檢測(cè)。本方法具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合大量臨床樣本的快速檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種改進(jìn)的人血清中15種膽汁酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，本方法步驟包括蛋白質(zhì)沉淀、樣品稀釋、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析檢測(cè)，具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合大量臨床樣本的快速檢測(cè)。

背景技術(shù)

膽汁酸為膽汁的主要成分，是一類膽烷酸的總稱。膽汁酸具有多種同分異構(gòu)體，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為游離型和結(jié)合型膽汁酸，游離型膽汁酸主要包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和石膽酸，結(jié)合型膽汁酸為上述游離型膽汁酸與甘氨酸和牛磺酸結(jié)合的產(chǎn)物。根據(jù)生成部位，膽汁酸又可分為初級(jí)和次級(jí)膽汁酸。膽汁酸主要在肝細(xì)胞中合成代謝轉(zhuǎn)化，膽汁酸在脂肪代謝中發(fā)揮重要作用，例如，膽汁酸可以促進(jìn)脂肪分解吸收，膽汁酸的分子結(jié)構(gòu)同時(shí)具有親水性和疏水性基團(tuán)，與界面活性分子一樣，能夠降低油相和水相之間的表面張力，促進(jìn)脂類的乳化。同時(shí)，膽汁酸可預(yù)防人體膽結(jié)石產(chǎn)生，膽固醇隨膽汁排入膽囊中儲(chǔ)存，膽囊中膽汁濃縮后，膽固醇易沉淀析出形成膽結(jié)石，膽汁酸鹽和卵磷脂可以使膽固醇分散成可溶性的微團(tuán)，從而抑制結(jié)石的產(chǎn)生。此外，膽汁酸參與體內(nèi)的腸肝循環(huán)，從而提高其使用效率。肝膽功能異常患者膽汁酸合成轉(zhuǎn)化能力和腸肝循環(huán)功能異常，其血清膽汁酸譜會(huì)發(fā)生顯著的改變。例如，孕婦在妊娠中晚期會(huì)特發(fā)一種妊娠期肝內(nèi)膽汁酸淤積癥(ICP)，易導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫及早產(chǎn)，甚至引起胎死宮內(nèi)等不良圍產(chǎn)結(jié)局。ICP孕婦最顯著的生化異常是血清中膽汁酸快速升高，血清膽汁酸是ICP診斷的最常用指標(biāo)。目前臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)膽汁酸的測(cè)定多為總膽汁酸測(cè)定，但是對(duì)于不同疾病，總膽汁酸可能相同，但膽汁酸譜不同。例如，臨床ICP和妊娠期無癥狀高膽汁酸血癥(AHP)均引起總膽酸的升高，難以根據(jù)總膽汁酸水平進(jìn)行區(qū)分，但從膽汁酸分型水平分析，AHP主要特征為熊脫氧膽酸升高，而ICP表現(xiàn)為石膽酸和游離膽汁酸升高。總之，血清膽汁酸譜的檢測(cè)對(duì)于臨床評(píng)價(jià)肝膽功能和疾病診斷，特別是對(duì)于不同類型的肝膽疾病的診斷，具有重要的指導(dǎo)意義。

目前常用的膽汁酸檢測(cè)方法主要有酶循環(huán)法和高效液相色譜法，這些檢測(cè)方法主要存在以下一些問題：酶循環(huán)法只能檢測(cè)總膽汁酸含量，無法準(zhǔn)確區(qū)分膽汁酸的不同分型，無法對(duì)疾病進(jìn)行更準(zhǔn)確的分析診斷和鑒別，臨床指導(dǎo)意義有限；高效液相色譜法需要衍生處理，特別是牛磺酸結(jié)合型膽汁酸還需要水解后再衍生化，前處理操作步驟十分復(fù)雜；此外，膽汁酸的紫外吸收較弱，色譜法采用的紫外檢測(cè)器靈敏度無法滿足臨床檢測(cè)需求，因此該方法的臨床應(yīng)用有很大局限性。總之，現(xiàn)有的傳統(tǒng)方法檢測(cè)膽汁酸不僅前處理方法繁瑣、需要較長(zhǎng)人工操作過程、后續(xù)儀器檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、膽汁酸的檢測(cè)種類受限，且檢測(cè)特異性較差、靈敏度低，這些都限制了膽汁酸檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于此，本發(fā)明提供一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，本方法具有極好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分測(cè)定15種分型膽汁酸，對(duì)疾病的診斷和治療具有更好的指導(dǎo)意義。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法檢測(cè)人血清中15種膽汁酸包括樣品前處理過程，稀釋過程，液相色譜分離過程，質(zhì)譜檢測(cè)過程。通過液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，且生物樣本基質(zhì)干擾小，儀器配有自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，樣本檢測(cè)可以24小時(shí)不間斷進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化和高通量。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)人血清中15種膽汁酸的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)蛋白沉淀：取50～500μL人血清樣本，依次加入50～500μL蛋白沉淀劑和0.1～1mL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻后離心；

(2)稀釋：取步驟(1)中處理后的上清液50～200μL與100～200μL稀釋劑混勻；

(3)將步驟(2)得到的樣本，上高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)樣5～50μL分析檢測(cè)。