[發明專利]一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010799040.2
• 申請日: 2020-08-11
• 公開（公告）號: CN111978401A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 陶建平;李文靜;劉丹丹;程振揚;徐向東;候照峰;許金俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K16/20
• 分類號: C07K16/20;C07K14/455;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/577;C12R1/19
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 劉妍妍

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，包括EnGAM22重組蛋白的制備、動物免疫、雜交瘤細胞的制備和單克隆抗體的制備，EnGAM22重組蛋白免疫小鼠后可產生高效價抗體，制備的雜交瘤細胞株可穩定分泌高性能抗EnGAM22蛋白單克隆抗體。本發明還公開了一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體，亞型分別為IgG2a、IgG2b，結合能力強、特異性好、效價高。本發明還公開了EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球蟲蟲體中的定位，特異性強，準確性好。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗毒害艾美耳球蟲配子體 EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法及其應用。

背景技術

雞球蟲病(Coccidiosis)是集約化雞場最常見的禽病之一，給養雞業造成巨大的經濟損失。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是雞球蟲病的主要病原之一，寄生于雞的小腸中段，引起雞的急性小腸球蟲病，主要危害8～18周齡的青年雞。近年來隨著雞球蟲病活疫苗的推廣應用，以及黃羽雞飼養周期相對較長且常采用地面放養或圈養，使得毒害艾美耳球蟲引起的急性小腸球蟲病越來越多見。因此，迫切需要對該球蟲的生物學與分子生物學進行深入研究，發現藥物或免疫治療靶點、或疫苗候選抗原。

卵囊是球蟲類寄生蟲在宿主間傳播的重要發育階段，是由球蟲在配子生殖時受精后的大配子發育而成，其囊壁是由位于球蟲大配子體成壁體中的蛋白形成，但配子體蛋白形成卵囊壁的分子機制尚不清楚。單克隆抗體具有很高的特異性和靈敏性，與免疫熒光、免疫電鏡等技術結合可將目的抗原定位在蟲體，是研究寄生蟲蟲體細微結構和發育分子機制的重要檢測試劑，對于寄生蟲病的免疫治療與機理研究也具有重大意義。迄今，有關毒害艾美耳球蟲卵囊壁蛋白單克隆抗體的研制與應用尚未見有報道。為此，本專利制備的抗毒害艾美耳球蟲配子體蛋白的單抗，可用于研究球蟲卵囊壁形成的分子機制以及配子體蛋白的功能，解析球蟲配子體蛋白亞單位疫苗的免疫保護機制等。

發明內容

為了克服現有技術不足，本發明目的之一在于提供一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，本方法用純化后的高濃度蛋白與一種新型的佐劑混合免疫小鼠可以產生高效價的抗體，制備的雜交瘤細胞株可持續分泌高性能的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體。

本發明目的之二在于提供一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體，由上述方法制備，亞型分別為IgG2a、IgG2b，抗體的特異性好，效價高。

本發明目的之三在于提供一種上述單克隆抗體鑒定EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球蟲蟲體表達情況的應用。

本發明的目的之一采用如下技術方案實現：

一種抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

將重組菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培養基中誘導培養，超聲破碎菌體后將上清用Ni-NTA親和純化層析柱純化并透析復性得到 EnGAM22重組蛋白；

采用EnGAM22重組蛋白注射小鼠體內進行免疫，選擇血清抗體效價達到評價標準的小鼠作為免疫小鼠；

對所述免疫小鼠注射不加佐劑的EnGAM22重組蛋白，取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，經選擇性培養后，再進行多次亞克隆，最終得到能穩定分泌特異性抗EnGAM22蛋白抗體的雜交瘤細胞；

對BALB/c雌性小鼠注射腹水專用佐劑，腹腔注射雜交瘤細胞，抽取腹水并純化得到抗EnGAM22蛋白單克隆抗體。

一種抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：