[發明專利]一種抗毒害艾美耳球蟲配子體EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010799040.2
• 申請日: 2020-08-11
• 公開（公告）號: CN111978401A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 陶建平;李文靜;劉丹丹;程振揚;徐向東;候照峰;許金俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K16/20
• 分類號: C07K16/20;C07K14/455;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/577;C12R1/19
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 劉妍妍

1.一種抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

將重組菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培養基中誘導培養，超聲破碎菌體后將上清用Ni-NTA親和純化層析柱純化并透析復性得到EnGAM22重組蛋白；

采用EnGAM22重組蛋白注射小鼠體內進行免疫，選擇血清抗體效價達到評價標準的小鼠作為免疫小鼠；

對所述免疫小鼠注射不加佐劑的EnGAM22重組蛋白，取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，經選擇性培養后，再進行多次亞克隆，最終得到能穩定分泌特異性抗EnGAM22蛋白抗體的雜交瘤細胞；

對BALB/c雌性小鼠注射腹水專用佐劑，腹腔注射雜交瘤細胞，抽取腹水并純化得到抗EnGAM22蛋白單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，小鼠免疫的方法為：用濃度為1.8mg/mL的EnGAM22重組蛋白與等體積的Quick Antibody-Mouse 3W混合進行腿部肌肉注射；第二周進行二次免疫；第三周眼眶后靜脈叢采血測定血清抗體效價。

3.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，雜交瘤細胞的制備方法為：對所述免疫小鼠腿部肌肉注射不加佐劑的EnGAM22重組蛋白，三天后取脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，經選擇性培養后，再進行三次亞克隆，最終得到能穩定分泌特異性抗EnGAM22蛋白抗體的雜交瘤細胞。

4.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，單克隆抗體的制備：選取10–12周齡的BALB/c雌性小鼠注射腹水專用佐劑，兩周后腹腔注射雜交瘤細胞，7d后抽取腹水并純化得到抗EnGAM22蛋白單克隆抗體；注射雜交瘤細胞的濃度為1×10⁶個細胞/只。

5.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述重組菌株pET28a(+)-Engam22/BL21在含有IPTG的LB培養基中37℃誘導培養4–6h。

6.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述免疫小鼠的血清抗體效價的評價標準為大于1﹕10 000。

7.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與脾細胞懸浮液的體積比為1﹕10。

8.根據權利要求1所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的純化方法為Protein G親和層析法。

9.一種抗EnGAM22單克隆抗體，其特征在于，由權利要求1–8任一項所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體的制備方法制備而成。

10.如權利要求9所述的抗EnGAM22蛋白單克隆抗體用于定位EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球蟲蟲體各階段表達情況的應用，其特征在于，包括以下步驟：

將毒害艾美耳球蟲配子體、未孢子化卵囊用PBS稀釋涂于載玻上，預冷的甲醇作用10min后洗滌，用0.1％Triton X室溫作用10min，10％山羊血清濕盒內37℃過夜封閉，一抗為雜交瘤細胞上清，濕盒內37℃孵育1h，二抗為FITC標記的羊抗鼠IgG，用10％山羊血清1﹕100倍稀釋，濕盒內37℃孵育1h，滴加抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察結果。