[發明專利]一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 202010798199.2
• 申請日: 2020-08-11
• 公開（公告）號: CN112375773A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 張革;郭松鶴;吳一仙
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12P21/02
• 代理公司: 深圳科灣知識產權代理事務所(普通合伙) 44585
• 代理人: 鐘斌

1.一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下制備步驟：

步驟一：具核梭桿菌的細菌培養，取出細菌凍存管，放置冰上，待其溶解，將Fn菌種接種于血平板上，在極度厭氧的條件下于37℃培養48-72h；

步驟二：細菌DNA的提取，刮取適量生長狀態良好的Fn菌落，置于1×PBS緩沖液中，提取細菌基因組DNA；

步驟三：NapA基因的擴增，以Fn細菌DNA為模板，根據以下條件進行擴增，反應體系為50μL，參數如下：預變性94℃1min，變性98℃10sec，退火68℃30sec，延伸72℃45sec，共進行30個循環，最后一個循環結束后再延伸72℃10min，PCR產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析；

步驟四：NapA基因與pGM-T載體連接，切膠回收的NapA基因6.0μL，pGM-T載體1.0μL，T4連接酶1.0μL，DNA連接緩沖液1.0μL，去離子水1.0μL，總體積10.0μL,混勻后16℃反應過夜；

步驟五：DH5α感受態細胞轉化；

步驟六：重組克隆的篩選與鑒定，挑取多個白色菌落分別接種于含有Amp的LB液體培養基中，250rpm，37℃震蕩培養過夜，提取質粒,雙酶切鑒定：取白色菌落質粒，進行雙酶切，反應體系：NcoI1.0μL，XhoI1.0μL，10×Kbuffer2.0μL，DNA10.0μL，ddH2O6.0μL，反應體積20.0μL，37℃酶切3h，1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.根據權利要求1所述的一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟六中主要溶液、培養基的配制包括：

LB液體培養基：胰蛋白胨2.0g，酵母提取物1.0g，NaCl2.0g加入去離子水200mL，攪拌均勻，120℃高壓滅菌20min；

LB固體含Amp培養基：胰蛋白胨2.0g，酵母提取物1.0g，NaCl2.0g，瓊脂粉3.0g加入去離子水200.0mL，攪拌均勻，120℃高壓滅菌20min，待LB固體培養基冷卻約60℃時，加入Amp至終濃度100.0μg/mL，倒平板。

3.根據權利要求1所述的一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟一中梭桿菌的菌種、引物、載體為Fn標準株；pGM-T載體；Fn-NapA的上游引物：5′-CCATGGGGAAAAACAAAGAAAATT-3′；Fn-NapA的下游引物：5′-CTCGAGTTTTAGCCATAGCTGAGAT-3′。

4.根據權利要求1所述的一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟六完成之后對重組質粒pGM-Fn-NapA進行Sanger測序。

5.根據權利要求1所述的一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟六完成之后對Fn-NapA進行3D結構模擬和預測Fn-NapA蛋白的二級結構。