[發明專利]一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 202010798199.2
• 申請日: 2020-08-11
• 公開（公告）號: CN112375773A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 張革;郭松鶴;吳一仙
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12P21/02
• 代理公司: 深圳科灣知識產權代理事務所(普通合伙) 44585
• 代理人: 鐘斌

本發明屬于生物醫學技術領域，具體為一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，包括如下制備步驟：步驟一：具核梭桿菌的細菌培養，取出細菌凍存管，放置冰上，待其溶解，將Fn菌種接種于血平板上，在極度厭氧的條件下于37℃培養48?72h；步驟二：細菌DNA的提取，刮取適量生長狀態良好的Fn菌落，置于1×PBS緩沖液中，提取細菌基因組DNA；步驟三：NapA基因的擴增，以Fn細菌DNA為模板，根據以下條件進行擴增，反應體系為50μL，本發明中的Fn?NapA蛋白擁有多個高抗原性肽段，具有較好的抗原性，并且與人體腸道共生菌之間有較小的交叉免疫反應，Fn疫苗候選抗原具有良好的發展前景。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體為一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法。

背景技術

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)是一種常見的革蘭氏陰性厭氧菌，是口腔炎疾病患者口腔中最豐富的微生物之一，中性粒細胞激活蛋白A (Neutrophil-activatingproteinA，NapA)最初是在H.pylori的水提取物中發現的可溶性蛋白，由于這種可溶性蛋白可以誘導中性白細胞產生活性氧自由基(ROI)，所以命名為中性粒細胞激活蛋白，NapA存在于Hp和Fn大多數菌株中，是一種保守的，抗原性強的蛋白，近年來，重組NapA主要作為對抗Hp感染的候選疫苗，在大多數Hp感染患者體中，含有高水平的NapA抗體，Rossi等采用HP-NapA與Hp另外兩個致病因子Cag、VacA聯合免疫比格犬可以減少Hp 的定植感染，Satin等發現用Hp-NapA免疫小鼠可減少幽門螺旋桿菌的感染，保護率高達80％，有研究發現口服Hp-NapA疫苗和免疫調節劑，可以控制Hp感染， Dong等發現霍亂毒素B(CTB)與NapA聯合口服可以抑制小鼠過敏性炎癥，目前仍缺少Fn-NapA基因作為抗原的應用。

發明內容

本部分的目的在于概述本發明的實施方式的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施方式。在本部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

鑒于上述和/或現有保護抗原中存在的問題，提出了本發明。

因此，本發明的目的是提供一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，能夠制備Fn-NapA蛋白，Fn-NapA蛋白擁有多個高抗原性肽段，具有較好的抗原性，并且與人體腸道共生菌之間有較小的交叉免疫反應，Fn疫苗候選抗原具有良好的發展前景。

為解決上述技術問題，根據本發明的一個方面，本發明提供了如下技術方案：

一種具核梭桿菌中性粒細胞激活蛋白的制備方法，包括如下制備步驟：

步驟一：具核梭桿菌的細菌培養，取出細菌凍存管，放置冰上，待其溶解，將Fn菌種接種于血平板上，在極度厭氧的條件下于37℃培養48-72h；

步驟二：細菌DNA的提取，刮取適量生長狀態良好的Fn菌落，置于1×PBS 緩沖液中，提取細菌基因組DNA；

步驟三：NapA基因的擴增，以Fn細菌DNA為模板，根據以下條件進行擴增，反應體系為50μL，參數如下：預變性94℃1min，變性98℃10sec，退火68℃ 30sec，延伸72℃45sec，共進行30個循環，最后一個循環結束后再延伸72℃ 10min，PCR產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析；

步驟四：NapA基因與pGM-T載體連接，切膠回收的NapA基因6.0μL，pGM-T 載體1.0μL，T4連接酶1.0μL，DNA連接緩沖液1.0μL，去離子水1.0μL，總體積10.0μL,混勻后16℃反應過夜；

步驟五：DH5α感受態細胞轉化；