[發明專利]一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗的構建方法

有效

• 申請號: 202010798191.6
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111944769B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 李有文;童劍軍;何川川;張雪萍;米麗開姆·托合提尼亞孜;高娜;楊勇飛
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/47;C12N15/65;C12N5/071;A61K39/295;A61K39/205;A61K39/275;A61P31/20;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 程華

本發明公開了一種狂犬病毒G蛋白?羊痘病毒重組疫苗的構建方法，包括以下步驟：步驟1、重組病毒疫苗構建模型設計；步驟2、各基因的擴增及各組合基因的融合擴增；步驟3、各種組合重組轉移載體的構建；步驟4、狂犬病毒G蛋白?羊痘病毒的重組及病毒純化；步驟5、狂犬病毒G蛋白表達檢測；步驟6、狂犬病毒G蛋白?山羊痘重組病毒疫苗株免疫效果檢測。本發明的方法構建的疫苗可有效預防羊狂犬病，并且具有生產高效、簡便、實用的特點，適合推廣應用。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗的構建方法。

背景技術

狂犬病是由狂犬病毒引起的高度致死性和接觸性人獸共患病，幾乎所有哺乳動物均可感染。我國是狂犬病高發國家之一，加之疆土富遠遼闊，狼、狐貍等野生動物攜帶狂犬病毒的可能性較大，因此牧區牛羊受野生動物攻擊而感染狂犬病的情況時有發生；加之寵物業興起，寵物犬咬傷羊只而發病者亦有報道。如山西、內蒙、新疆等地均有牛羊被犬咬傷感染狂犬病的案例。羊痘病毒是痘病毒科的成員，是大型的線形DNA病毒，其基因組可容納大量外源基因而不影響病毒的正常生長繁殖，因此其往往被作為載體構建生產活載體疫苗。

雖然目前狂犬疫苗可以有效的預防狂犬病的發生，但是注射狂犬疫苗成本高，周期長，程序復雜，很難在羊群中推廣使用。為有效預防羊狂犬病，生產高效、簡便、實用的疫苗非常必要，狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗可能是最好選擇。

發明內容

本發明的目的在于提供一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗及其構建方法，該方法以山羊痘病毒疫苗株為病毒活載體，以其腺甘酸酶基因(TK)為復制非必需區，以VV7.5基因或GTPV-A8R基因為啟動子，綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，利用基因工程技術設計了10種能夠重組狂犬病毒保護性抗原(G蛋白：GQ為G蛋白全長，GW為G蛋白膜外區)的表達載體；制備培養了羔羊睪丸原代細胞，用LipofectamineTM 2000轉染試劑通過脂質體轉染法將構建成功的8株重組轉移載體分別轉入預先感染羊痘病毒疫苗株的羔羊睪丸細胞中，經同源重組成功并將其培養獲得能夠表達狂犬病毒G蛋白的重組羊痘病毒，然后運用低熔點瓊脂糖固定、挑熒光斑點和倍比稀釋傳代的方式進行純化，一般純化4-6代即可獲得較純的重組病毒毒株，并通過細胞GFP基因表達率、細胞病變及PCR方法確定重組病毒是否純化。并通過Western-blot和ELISA方法初步評價G蛋白在重組病毒中的表達效果。免疫羊只后，用ELISA方法檢測其血清中和抗體產生情況。

其具體技術方案為：

一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗的構建方法，包括以下步驟：

步驟1、重組病毒疫苗構建模型設計

根據痘病毒重組疫苗設計原理，選擇羊痘病毒TK基因為外源基因插入的非必需區，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R雙向啟動子為備選啟動子，綠色熒光光蛋白為報告基因，與狂犬病毒G蛋白構建重組病毒的表達載體。為了篩選最選的疫苗組合，共設計了10種組合，G蛋白選用了全長和膜外區兩種形式。

(1)TK基因中插入位點選Acc65 I；

(2)以VV7.5啟動子融合表達GFP和G蛋白：分為GFP在N端，G蛋白在C端和G蛋白在N端，GFP在C端兩種情況。G蛋白又有全長和膜外區兩種情況，總計設計4種整合表達的情況；

(3)以VV7.5分別為GFP和G蛋白的啟動子分別表達各自的蛋白，分表達方向相背和表達方向同向兩種情況。考慮G蛋白有全長和膜外區之分，共設計4種單獨表達的組合；

(4)以山羊痘病毒雙向啟動子A8R兩側分別表達G蛋白和GFP蛋白構建G蛋白全長和膜外區兩種情況。

步驟2、各基因的擴增及各組合基因的融合擴增

(1)引物設計