[發明專利]一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗的構建方法

有效

• 申請號: 202010798191.6
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111944769B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 李有文;童劍軍;何川川;張雪萍;米麗開姆·托合提尼亞孜;高娜;楊勇飛
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/47;C12N15/65;C12N5/071;A61K39/295;A61K39/205;A61K39/275;A61P31/20;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 程華

1.一種狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重組疫苗的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、重組病毒疫苗構建模型設計

根據痘病毒重組疫苗設計原理，選擇羊痘病毒TK基因為外源基因插入的非必需區，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R雙向啟動子為備選啟動子，綠色熒光蛋白為報告基因，與狂犬病毒G蛋白構建重組病毒的表達載體；為了篩選最優 選的疫苗組合，共設計了10種組合，G蛋白選用了全長和膜外區兩種形式；

步驟2、各基因的擴增及各組合基因的融合擴增

(1)引物設計

根據不同組合的具體設計需要，設計不同引物用于擴增目的基因片段，引物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：27所示；

(2)PCR擴增

G蛋白與GFP融合表達的形式采用三片段融合PCR法將兩蛋白基因與VV7.5啟動子融合在一起，先分別擴增單個基因片段，再將3個片段融合擴增在一起，TK基因直接普通PCR擴增；

VV7.5與G蛋白或GFP蛋白表達的情況以及A8R雙向啟動子與G蛋白和GFP蛋白的連接，先分別擴增單個基因片段，采用兩片段融合，再用酶切連接的方式構建；

步驟3、各種組合重組轉移載體的構建

(1)TK基因：將擴增的TK基因直接與克隆載體PGEM-T載體連接得PGEM13-TK載體，并鑒定；

(2)酶切：PGEM13-TK載體，各融合PCR產物均進行Acc65 I的酶切；50μL酶切體系為：載體和PCR產物分別為35μL和30μL，Buffer各5μL，Acc65 I各3μL，ddH₂O分別為7μL和12μL，混勻后于37℃水浴酶切3-4h，并對酶切產物進行切膠回收純化；對載體的酶切產物進行去磷酸化：去磷酸化酶2μL，10×Buffer 5μL，酶切載體20μL，ddH₂O 23μL；37℃1h，45℃15min；純化回收，-20℃保存；

(3)連接

處理好的PCR產物及載體運用T4 DNA連接酶進行連接；10μL體系：PGM-TK13載體1μL，目的片段5μL，T4 DNA連接酶1μL，10×T4 DNA連接酶Buffer 1μL，ddH₂O 2μL，并設立空白對照；

(4)轉化

將各連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞并涂板培養；

(5)轉移載體構建的鑒定

挑取單菌落振搖培養6-8h，以菌液為模板進行PCR擴增鑒定；

提取質粒做酶切鑒定；

最終成功構建狂犬病毒G蛋白-山羊痘病毒重組病毒轉移載體8種：PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP，其序列如SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：35所示；

步驟4、狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒的重組及病毒純化

(1)細胞制備：制備羊睪丸原代細胞；

(2)羊痘病毒疫苗株的培養：待羊睪丸原代細胞長好，接種山羊痘病毒疫苗株AV41，并觀察生長情況；

(3)病毒重組：將構建并測序正確的重組轉移載體PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GPP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP用Lipofectamin^TM2000脂質體轉染試劑轉染至已經感染了山羊痘病毒疫苗株的羊睪丸原代細胞，培養并觀察細胞病變情況及綠色熒光情況；具體步驟如下：

待12孔板中羊睪丸原代細胞長至85-90％，吸棄細胞培養液，每孔接種10μL的羊痘病毒疫苗株病毒液和細胞維持液，37℃二氧化碳培養箱培養12h；每孔準備2個無菌離心管，加入250μL DMEM，一管中加入轉染試劑Lipofectamine^TM 2000 1.5μL，用移液器混勻，靜置5min，另一管中加入轉移載體質粒；將轉染試劑混勻液加入質粒中，混勻之后靜置18～20min；將混勻液加入細胞板孔中，6～8h后換細胞維持液，于細胞培養 箱中培養，并于12h、24h、36h、48h分別觀察綠色熒光出現情況，出現熒光細胞即為重組病毒細胞；同時作不接種病毒直接轉染質粒的對照；

(4)重組病毒的純化

確認有帶熒光的重組病毒后，吸棄培養液，加入已融化的無菌低熔點瓊脂糖，并置于4℃的冰箱中5～10min，待固定液凝固后取出，在熒光顯微鏡下挑取熒光斑點于50μL DMEM純培養液中備用；將挑取的熒光斑點收集液反復凍融三次后，對其進行10倍比稀釋至10⁶-10⁷，然后分別接種羊睪丸原代細胞培養，再挑取熒光斑點稀釋，如此傳代4-6次，得到純化的重組病毒；

(5)重組病毒純化的鑒定

鏡檢：熒光顯微鏡觀察有幾乎99％的細胞均帶熒光，說明重組病毒已經純化，最終得到重組純化的重組病毒兩株：rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5；

PCR檢測：取重組病毒的細胞培養物，提取其基因組，PCR檢測其中G蛋白基因、GFP基因及TK基因，同時與山羊痘病毒疫苗株的細胞培養物做比較；

步驟5、狂犬病毒G蛋白表達檢測

(1)G蛋白Western-blot檢測

細胞培養純化的重組病毒，細胞裂解液200μL裂解其培養物并用細胞鏟刮取裂解產物，加SDS-PAGE上樣Buffer并于沸水浴煮沸10min；做SDS-PAGE電泳，并按常規方法做考染或western blot檢測；

(2)ELISA法檢測細胞培養物中G蛋白表達情況

培養標準山羊痘疫苗株及已純化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重組病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，細胞全部被感染后，收取培養上清液并刮取底層細胞，細胞加細胞裂解液裂解并超聲破碎，將其離心分為細胞上清和細胞沉淀；購買狂犬病毒G蛋白抗原檢測ELISA試劑盒，常規方法檢測以上處理樣品中G蛋白含量；兩株重組病毒G蛋白表達量與對照組山羊痘疫苗株顯著升高，差異極顯著，且G蛋白膜外區的表達量明顯高于全長；另外對細胞培養液、細胞破碎后上清及沉淀中G蛋白含量的檢測結果是細胞培養液和細胞破碎后上清中G蛋白含量接近，且明高于細胞破碎后沉淀中，說明G蛋白表達后主要以分泌型蛋白形式表達在細胞外，非常適合做免疫抗原，是制備疫苗的最佳抗原蛋白；

步驟6、狂犬病毒G蛋白-山羊痘重組病毒疫苗株免疫效果檢測

(1)重組羊痘疫苗株注射液的制備

取標準羊痘疫苗株及已純化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重組病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5各取50μL接入至含5mL羔羊睪丸原代細胞的小25mL的細胞瓶中；5天細胞全部感染后反復凍融三次，12000rpm 10min離心取上清液，于-80℃保存；

(2)免疫接種試驗

將12只健康狀態一致的成年綿羊分為三組并標記，標準疫苗株：A、B、C、D；G蛋白全長重組疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5：I、II、III、IV；G蛋白膜外區重組疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5：1、2、3、4，采集羊免疫前血清待檢；按分組在羊尾根部皮內注射0.5mL重組羊痘疫苗株注射液；觀察羊只健康狀況，并分別于0、5、12、19d采集羊全血分離血清待檢；

(3)血清中G蛋白中和抗體檢測

購買綿羊源G抗體檢測試劑盒，按說明書進行操作檢測羊血清中G蛋白中和抗體水平情況，與山羊痘病毒疫苗株的免疫血清為對照；兩株重組病毒免疫組羊血清中G蛋白中和抗體與對照組顯著升高，差異極顯著，且G蛋白膜外區的中和抗體濃度明顯高于全長。