[發明專利]一種神經脫細胞預處理方法

有效

• 申請號: 202010795522.0
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111714701B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 敖強;毓天昊;張興棟
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36
• 代理公司: 成都市集智匯華知識產權代理事務所(普通合伙) 51237
• 代理人: 陳慕華

本發明提供一種神經脫細胞預處理方法，所述方法首先通過高滲溶液和低滲溶液交替處理對細胞進行初步裂解，再利用單向冷凍干燥技術得到具有微通道的神經，進一步進行軸向穿刺，得到內部形成大通道的神經。神經經過預處理后，使用濃度較低的溫和去污劑就能實現脫細胞效果，且對神經ECM分子破壞性較小。通過上述方法脫細胞得到的神經與傳統Sondell脫細胞法制備得到的神經相比，其能更加有效的支持施萬細胞滲入和遷移，具有更好的生物相容性，且作為移植物具有更好的神經修復效果。

技術領域

本發明屬于神經生物學技術領域，具體涉及一種神經脫細胞預處理方法以及涉及所述預處理方法的一種神經脫細胞方法。

背景技術

周圍神經是聯絡中樞神經和其它組織器官的重要神經結構，但是，臨床上每年全球范圍內有數百萬人遭受周圍神經損傷，由于預后不佳，對患者致殘率較高。周圍神經損傷往往伴有神經完整性的破壞，乃至神經缺損，導致早期無張力的直接縫合無法實施，這時就需要應用移植物來連接神經斷端，恢復神經連續性。目前，自體神經移植被認為是修復周圍神經缺損的“金標準”，在臨床上應用廣泛。然而，自體神經來源有限，且可供移植的神經均為皮神經，此外，當神經缺損長度大于7cm或者患者年齡大于50歲時，自體神經移植的修復成功率明顯下降。這些因素極大的限制了自體神經的臨床應用。

隨著生物材料學和組織工程學的不斷發展，大量組織工程神經被研發出來，如中空型神經導管。中空型神經導管可以在損傷神經的斷端之間形成相對密閉的再生微環境，但是，中空型導管的內部缺乏新生細胞和軸突定向遷移和延伸所需的引導性因素，使新生軸突排列紊亂和錯位愈合，難以獲得滿意的神經修復效果。而且，中空型神經導管主要用于修復長度小于2mm的神經缺損。

除此之外，脫細胞異體神經因為其特有的優勢，有望成為自體神經可能的替代物，近來受到相關學者的廣泛關注。異體組織移植的主要問題在于免疫排斥反應，會對神經再生造成極大的不利影響，最終導致移植物的排異和修復失敗。神經經過脫細胞處理后，施萬細胞、血管內皮細胞、束膜細胞等細胞性成分以及神經軸突與髓鞘等結構性成分均被去除，可以獲得以基底膜管為主要結構的天然神經ECM(細胞外基質)三維支架。這種脫細胞基質成分的抗原性極小，大大降低了免疫排斥反應發生的可能性。

為了制備脫細胞神經，近年來研究者開發了多種方法。目前，最為學界認可的是Sondell方法和Hudson方法，其作為常規神經脫細胞方法被廣泛使用。Sondell方法具體是通過TritonX-100和脫氧膽酸鈉反復處理以達到去除細胞性成分的目的。研究表明此方法可能獲得較好的脫細胞效果，但是由于離子型強效去垢劑脫氧膽酸鈉的應用，使得制備的脫細胞神經往往伴有細胞外基質成分和結構的較大破壞。為了更好地制備脫細胞神經，Hudson等人提出了一種基于TritonX-200、SB-10和SB-16的改良脫細胞方法，但是，近年來Hudson方法中關鍵試劑TritonX-200已經停售，并且這種試劑也難以自行穩定而有效地合成，因而使得此方法在進一步科研分析以及臨床診治中的應用受到極大限制。

另外，上述神經脫細胞方法均是對正常神經進行洗脫，正常神經的內部微結構比較致密，孔隙率較低，孔隙直徑較小，因此就需要濃度較大的去污劑進行洗脫，或者對神經進行長時間多次洗脫，這會對ECM造成較大的破壞。此外，不足的孔隙率和較小的孔隙直徑還難以滿足再生細胞的滲透和遷移的需要，并使種子細胞加載變得困難，導致細胞黏附率及分布均勻度不佳。上述問題均會影響神經修復效果。

為了解決上述問題，本發明提供一種神經脫細胞預處理方法，經過所述方法預處理后再進行脫細胞，能實現更好的神經脫細胞效果，且對ECM造成的破壞更小。與傳統Sondell脫細胞法制備得到的神經相比，本發明提供的神經脫細胞法制備得到的神經能更加有效的支持施萬細胞滲入和遷移，且具有更好的生物相容性，神經修復效果更佳。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種神經脫細胞預處理方法，本發明的另一個目的是提供一種神經脫細胞方法，所述方法使用溫和去污劑就能達到較好的脫細胞效果。本發明還有一個目的是提供一種基于所述脫細胞方法制備的神經及其用途。