[發明專利]一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法

在審

• 申請號: 202010795255.7
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111926095A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 劉寶山;陳澤良;劉金玲;楊國麗;韓小虎;沈國順;張歡
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物，其特征在于，包括上游外引物SEQ IDNo.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游內引物SEQ ID No.3和下游內引物SEQ ID No.4，分別命名為BF、BB、BFP和BBP，

上游外引物BF序列為：5'-AAGGAAGCTTCGGCAACG-3'；

下游外引物BB序列為：5'-GAAGATGACCGGCAGATCG-3'；

上游內引物BFP序列為：

5'-GCGATAACCTTCCGACTCCAGCGCTGGTTGATGATGACCGC-3'

下游內引物BBP序列為：

5'-GGATGGGTTGATGGCGCGTCCAGAAGCTCCATACCGTCCA-3'。

2.一種如權利要求1所述的LAMP引物的使用方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

(1)采用DNA提取試劑盒提取待測固體樣本的基因組作為擴增模板；或者將待測液體樣本加入等量蒸餾水后煮沸10分鐘后吸取上清作為擴增模板；

(2)預熱：擴增反應進行前，將暖貼的外包裝打開后，將暖貼卷緊進行預熱；

(3)試劑配制：在200μl PCR反應管中依次加入NEB WarmStart LAMP變色預混液8-12μL，上游外引物BF、下游外引物BB、上游內引物BFP、下游內引物BBP各1-2μL，擴增模板1-2μL，雙蒸餾水4-6μL后制得的LAMP擴增試劑；

(4)擴增：預熱完成后，打開卷緊的暖貼，將裝有LAMP擴增試劑的PCR反應管放在暖貼中間重新卷緊，進行LAMP擴增；

(5)結果判定：擴增完成后，打開暖貼取出200μlPCR反應管，如果溶液的顏色變為黃色，為陽性，則待測樣品中含有布魯氏菌；如果溶液的顏色仍為紅色，為陰性，則待測樣品中不含有布魯氏菌。

3.根據權利要求2所述一種LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步驟(2)中，當環境溫度低于10℃時，預熱時間為75-85min，當環境溫度大于等于10℃時，預熱時間為15-25min。

4.根據權利要求2所述一種LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步驟(3)中，NEBWarmStart LAMP變色預混液由Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、WarmStartRTx反轉錄酶和LAMP緩沖液。

5.根據權利要求4所述一種LAMP引物的使用方法，其特征在于，所述LAMP緩沖液由1mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液50mL，KCl 1.51g，MgSO₄1.95g，(NH₄)2SO₄2.68g，吐溫20 3mL和甜菜堿188.0g制成。

6.根據權利要求2所述一種LAMP引物的使用方法，其特征在于，上述步驟(4)中，擴增反應的時間為50-70min。