[發(fā)明專利]一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法

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• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111926095A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設計）人: 劉寶山;陳澤良;劉金玲;楊國麗;韓小虎;沈國順;張歡
• 申請（專利權）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發(fā)明公開一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物，包括上游外引物SEQ ID No.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游內(nèi)引物SEQ ID No.3和下游內(nèi)引物SEQ ID No.4，分別命名為BF、BB、BFP和BBP。本發(fā)明還公開一種利用暖貼和LAMP引物進行現(xiàn)場LAMP檢測的方法，包括以下操作步驟：(1)提取待測樣本的基因組作為擴增模板；(2)預熱：擴增反應進行前，將暖貼的外包裝打開后，將暖貼卷緊進行預熱；(3)配制LAMP擴增試劑；(4)將配制好的試劑置于預熱好的暖貼中進行LAMP擴增；(5)結果判定。本發(fā)明方法基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物和暖貼加熱方法，實現(xiàn)對布魯氏菌的無設備快速檢測，便于現(xiàn)場布魯氏菌病的診斷，更好地進行布魯氏菌病的防控和凈化。

技術領域

本發(fā)明屬于布魯氏菌檢測技術領域，具體涉及一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法。

背景技術

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜獸共患傳染病，廣泛分布于世界各地，不僅影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，而且危害人類健康。布魯氏菌感染動物機體后，可進入細胞內(nèi)生存繁殖。在這個過程中，感知調節(jié)蛋白BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)通過調節(jié)外膜蛋白的表達和碳氮代謝改變細菌毒力和外膜的通透性，對布魯氏菌在細胞內(nèi)生存和致病力方面具有重要的作用?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，BvrR/BvrS變異株中約一半的外膜蛋白表達下降，另一半則上調，同時多種胞質蛋白也上調，表明布魯氏菌的毒力與調節(jié)細胞外膜和代謝的網(wǎng)絡有關。BvrR變異株中碳代謝和反硝化的基因表達上調，而VjbR,ExoR和OmpR等轉錄調節(jié)子表達下調，表明其控制著菌體的碳氮代謝，可改變細菌的生理特性，有利于其從細胞外到細胞內(nèi)寄生的轉換。進一步的研究表明：BvrR/BvrS雙組分調節(jié)系統(tǒng)還對布魯氏菌細胞內(nèi)寄生的另一重要因素—Ⅳ分泌系統(tǒng)VirB(T4SS VirB)具有調節(jié)作用，間接調節(jié)細菌的毒力和胞內(nèi)生存能力。BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)對布魯氏菌是如此的重要，以至于在所有致病菌種中都存在?，F(xiàn)已有多種檢測布魯氏菌的檢測方法，但這些方法普遍存在著操作復雜、費時、費用高的問題，不便于快速檢驗以指導臨床。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothennal amplification,LAMP)通過針對靶基因的6個區(qū)域而設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下幾十分鐘就可擴增出109靶序列拷貝。該方法克服了PCR技術需要昂貴的儀器設備的缺點，產(chǎn)物可以不需任何儀器即時觀察，極其適合在臨床及基層進行現(xiàn)場檢測(Point-Of-Care Testing，POCT)，因此其產(chǎn)生后已經(jīng)被用來研究開發(fā)了多種檢測產(chǎn)品。目前開發(fā)了諾如病毒的LAMP檢測試劑盒和禽流感、SARS、西尼羅河病毒、牛胚胎性別檢測等19種LAMP檢測產(chǎn)品試劑盒，目前沒有一種基于布魯氏菌BvrR序列采用LAMP手段檢測布魯氏菌的方法。另一方面，環(huán)介導等溫擴增技術在實際使用過程中，其擴增過程需要恒溫裝置，此要求影響了其在無設備現(xiàn)場檢測中的應用，因而成為其廣泛應用的一大障礙。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物及其使用方法，拓展了其在簡陋的生產(chǎn)現(xiàn)場進行檢測的能力，有利于布魯氏菌病的快速檢測和診斷。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的。

一種基于布魯氏菌BvrR序列的LAMP引物，包括上游外引物SEQ ID No.1、下游外引物SEQ ID No.2、上游內(nèi)引物SEQ ID No.3和下游內(nèi)引物SEQ ID No.4，分別命名為BF、BB、BFP和BBP，

上游外引物BF序列為：5'-AAGGAAGCTTCGGCAACG-3'；

下游外引物BB序列為：5'-GAAGATGACCGGCAGATCG-3'；

上游內(nèi)引物BFP序列為：

5'-GCGATAACCTTCCGACTCCAGCGCTGGTTGATGATGACCGC-3'