[發明專利]一種馬立克氏病病毒血清1型熒光定量PCR試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202010794930.4
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111733296A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 陳曉春;蘇佳;趙煒;吳華偉;黃小潔;曹明慧;鄧永;孔冬妮;薛青紅
• 申請（專利權）人: 中國獸醫藥品監察所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

本發明涉及一種檢測馬立克氏病病毒血清1型毒株的熒光定量PCR試劑盒及其在禽用生物制品質量控制中的應用。所述試劑盒含有用于檢測馬立克氏病病毒血清1型毒株的一對特異性引物和相應的Taqman探針。本發明用于檢測馬立克氏病病毒血清1型，特異性好，除馬立克氏病病毒血清1型毒株能擴增出特異性曲線外，其他禽用病毒類生物制品及其生產原材料均未擴增出特異性曲線；本發明敏感性高，用本發明建立的方法檢測不同PFU的馬立克氏病病毒血清1型毒株，檢出限度為0.006PFU；檢測10倍梯度稀釋的標準品質粒，檢出限度為32.8copies/μL；本發明可用于禽用生物制品中外源性馬立克氏病病毒的檢測，對于馬立克氏病病毒的檢測、禽用生物制品質量控制等具有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種馬立克氏病病毒(Marker’s disease virus,MDV)血清1型熒光定量PCR試劑盒及其在禽用生物制品質量控制中的應用，屬于生物技術和動物病毒學領域。

背景技術

馬立克氏病(Marker’s disease,MD)是雞的一種急性或亞急性淋巴細胞增生性疾病，主要表現為外周神經、皮膚、虹膜及其他組織器官出現單核細胞浸潤。該病的病原馬立克氏病病毒(Marker’s disease virus,MDV)屬于α皰疹病毒亞類的Mardivirus屬，根據病毒的血清學反應，分為3個血清型，即MDV血清1型(禽皰疹病毒2型)、MDV血清2型(禽皰疹病毒3型)和MDV血清3型(火雞皰疹病毒1型)。與其它皰疹病毒相比，禽皰疹病毒最顯著的特性是細胞結合性，即在細胞培養上不產生游離于細胞培養液中有感染性的病毒粒子(特別是MDV血清1型毒株)。

基于MDV的生物學特性，現有外源性MDV檢驗方法主要是通過雞胚法觀察尿囊膜病變、細胞法檢查細胞病變、雞檢查法通過瓊脂擴散實驗測定抗體。但隨著獸用生物制品品種的不斷增加和生物技術的不斷進步，現有的外源性MDV檢驗國家標準已不能完全滿足檢驗、檢測的需求。主要表現在兩個方面：一是方法敏感性問題，如雞檢查法中MDV采用瓊脂擴散實驗進行抗體檢測，敏感性低、穩定性差、檢測時間長、不同來源檢測抗原反應性差異較大；二是方法的鑒別性不強，如不同血清型馬立克氏病病毒相互污染時，無法進行外源性馬立克氏病病毒的鑒別。

熒光定量PCR已作為一種快速、靈敏的診斷方法被廣泛使用，特別是在取代傳統方法不易或不能檢測的病原的檢測方面具有重要意義。2019年，在非洲豬瘟肆虐的形勢下，對于不易分離鑒定的非洲豬瘟病毒，我國農業農村部及時制定了豬用生物制品及豬源原輔材料中污染非洲豬瘟病毒的PCR和熒光定量PCR檢測方法，為嚴把獸用生物制品質量關，做好非洲豬瘟防控提供了堅實的技術保障。而目前禽用生物制品中，外源性MDV檢測國家標準中并無分子生物學相關的檢測技術，因此，我們選擇編碼MDV核衣殼蛋白UL19的基因為靶標，建立MDV血清1型毒株熒光定量PCR檢測方法，用于禽用生物制品外源性馬立克氏病病毒污染的質量控制。

發明內容

本發明為克服現有外源性馬立克氏病病毒檢測方法敏感性低、鑒別性不強、檢測時間長等的缺點，提供了一種特異、敏感、快速、可定量檢測外源性馬立克氏病病毒血清1型毒株的熒光定量PCR試劑盒，應用于禽用生物制品質量控制。

為實現上述目標，本發明實施了以下技術方案：

1.一種馬立克氏病病毒血清1型熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包含特異性引物、相應的Taqman探針、qPCR Buffer(2×)、酶、標準品質粒、無酶水；

所述的特異性引物和相應的Taqman探針，其序列分別為：

序列1上游引物(MDV1-UL19-F)：5′-attcctggat gcaaacccgt-3′20

序列2下游引物(MDV1-UL19-R)：5′-tattccacgt tccgtcagcc-3′20