[發明專利]聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶、制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202010793905.4
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111893100A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 魏景艷;王艷偉;閆琦
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N9/96;A61K38/44;A61K47/60;A61K8/66;A61P39/06;A61Q19/08;A23L33/17
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶(mPEG?GPX)、制備方法及其在制備抗氧化藥物、保健品和化妝品方面的應用，屬于生物技術領域。本發明是將活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEG?SS)與重組谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的氨基共價偶聯得到mPEG?GPX。GPX經聚乙二醇修飾后，產物mPEG?GPX的穩定性較GPX明顯增強，mPEG?GPX的體內抗氧化效果優于GPX，有利于mPEG?GPX保健品的開發利用；得到的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶提高了重組谷胱甘肽過氧化物酶的pH耐受性和熱穩定性以及抗蛋白酶水解的能力，有效地延長重組谷胱甘肽過氧化物酶在體內的循環半衰期，增加藥物的穩定性并提高藥效。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及聚乙二醇修飾蛋白質類化合物，具體涉及一類聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶(mPEG-GPX)、制備方法及其在制備抗氧化藥物、保健品和化妝品方面的應用。

背景技術

谷胱甘肽過氧化物酶是一類重要的酶，和超氧化物歧化酶及過氧化氫酶共同構成機體主要的抗氧化酶系。谷胱甘肽過氧化物酶能夠通過催化還原性谷胱甘肽與過氧化氫的反應，從而阻斷氧自由基對機體組織的損傷。但是天然谷胱甘肽過氧化物酶的來源有限，性質不穩定，為解決這一問題，中國專利201510431360.1公布了一種雜合tRNA及其在制備谷胱甘肽過氧化物酶中的應用，成功制備了酶蛋白活力和產量高、穩定性好的重組谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)。研究表明，重組谷胱甘肽過氧化物酶具有很好的抗氧化效果，在醫藥領域、化妝品行業和保健品領域均具有較高的應用價值。

作為一類蛋白質，重組谷胱甘肽過氧化物酶擁有大多數蛋白質類普遍面臨和急需解決的問題，如在體內的循環半衰期短、穩定性差、免疫原性強且易被蛋白酶水解等。因此重組谷胱甘肽過氧化物酶的開發應用受到限制。

聚乙二醇(PEG)是一類安全、無毒且具有良好生物相容性的高分子聚合物，被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于生物醫藥產業。蛋白質的聚乙二醇修飾，即在蛋白質上偶聯PEG分子，是一種改善藥用蛋白質藥效的有效手段。自上世紀70年代以來，人們便開始利用聚乙二醇修飾蛋白質類藥物，1977年Abuchowski等人報道利用PEG修飾牛血清白蛋白可以降低其免疫原性，并能夠顯著延長藥物的體內循環半衰期，在70年代后期，聚乙二醇修飾已成為提高蛋白質循環半衰期的首選技術。自1990年PEG修飾的腺苷脫氨酶首次上市以來，該技術成功地應用于商業蛋白藥物生產，并且已經有多種聚乙二醇修飾的蛋白質類藥物上市。

中國專利201110122788.X公開了一種修飾性谷胱甘肽過氧化物酶及其制備方法，該專利利用分子量為5kD的直鏈單甲氧基聚乙二醇中的游離氯原子與豬谷胱甘肽過氧化物酶中的氨基共價偶聯，對修飾產物進行超濾操作去除終止劑，得到修飾性豬谷胱甘肽過氧化物酶。在該專利中，氨基修飾率達40％～45％，在50℃條件下，1.5h后相對酶活力為37％，在pH10.0條件下，1.5h后修飾酶的相對酶活力保持在68.79％。經胰蛋白酶水解之后，修飾酶活力是最初的64.43％。

中國專利201810823075.8公開了聚乙二醇修飾的重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體、制備方法及抗氧化應用，該制備方法提供了一種重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體的單甲氧基聚乙二醇修飾工藝。該專利采用分子量為5kD的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯與重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體的氨基發生反應，其氨基修飾率為98.73％，在55℃時，單甲氧基聚乙二醇修飾的重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體的相對酶活力為59.04％。但是從該公開專利的附圖2可以發現這種反應產物實際上是多種修飾產物的混合物質，給后續分離純化增加了挑戰和成本，且該專利修飾的蛋白質是分子中不含半胱氨酸的重組谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體。

因此，本領域迫切需要提供一種生產無毒性、修飾產物單一且抗氧化效果好的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法。

發明內容