[發明專利]聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶、制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202010793905.4
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111893100A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 魏景艷;王艷偉;閆琦
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N9/96;A61K38/44;A61K47/60;A61K8/66;A61P39/06;A61Q19/08;A23L33/17
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 劉世純;王恩遠

1.一種聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶，其結構式如下：

其中，GPX表示重組谷胱甘肽過氧化物酶，mPEG表示活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯中的單甲氧基聚乙二醇部分。

2.權利要求1所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其步驟如下：

(1)重組谷胱甘肽過氧化物酶的獲取

制備重組谷胱甘肽過氧化物酶，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡鑒定重組谷胱甘肽過氧化物酶靶蛋白；

(2)修飾反應及分離純化

以平均分子量2～30kD的活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯作為修飾劑，與步驟(1)得到的重組谷胱甘肽過氧化物酶在4～37℃、pH6.0～9.0條件下進行10～60min的共價偶聯反應，重組谷胱甘肽過氧化物酶與修飾劑的摩爾比為1：5～60，然后加入終止劑甘氨酸終止反應；再將共價偶聯反應所得混合液用陰離子交換層析色譜分離純化，采用鹽濃度梯度洗脫方式洗脫目標產物，將含有目標產物的洗脫液收集透析除鹽，然后將目標產物凍干，即得到聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶，最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合考藍染色和碘染色兩種染色方式鑒定目標產物。

3.如權利要求2所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯的平均分子量為2～20kD。

4.如權利要求3所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯的平均分子量為5～20kD。

5.如權利要求2所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：重組谷胱甘肽過氧化物酶與修飾劑的摩爾比為1：5～50。

6.如權利要求5所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：重組谷胱甘肽過氧化物酶與修飾劑的摩爾比為1：10～30。

7.如權利要求2所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：共價偶聯反應的時間為20～30min，溫度為4～20℃，pH為7.4～8.5。

8.如權利要求2所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：活化的直鏈單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯和終止劑甘氨酸的摩爾比為1：1。

9.如權利要求2所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶的制備方法，其特征在于：陰離子交換層析色譜分離純化所使用的離子交換層析介質為DEAE-SEPHACEL層析介質，使用pH8.95、10mmol/L Tris.HCl平衡緩沖液平衡色譜柱內的層析介質，將反應液加入已平衡的含DEAE-SEPHACEL層析介質的色譜柱內，再用10mmol/L Tris.HCl平衡緩沖液洗脫未掛柱物質，出水口連接核酸蛋白檢測儀，色譜工作站監測核酸蛋白檢測儀在280nm的紫外吸收；待基線平穩后，采用鹽濃度梯度洗脫方式洗脫目標產物，洗脫緩沖液為pH8.95、含有1mol/L氯化鈉的10mmol/L Tris.HCl緩沖液。

10.權利要求1所述的聚乙二醇化單修飾重組谷胱甘肽過氧化物酶在制備抗氧化藥物、保健品或化妝品方面的應用。