[發(fā)明專利]制備Bietti結(jié)晶樣萎縮非人哺乳動物模型的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010793683.6
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111979271A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪楓樺
• 申請（專利權(quán)）人: 上海朗昇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種制備Bietti結(jié)晶樣萎縮非人哺乳動物模型的方法及其應(yīng)。所述方法包括使用Crispr?Cas系統(tǒng)將所述動物CYP4V3基因敲除轉(zhuǎn)錄本第一個外顯子敲除。本發(fā)明制備得到的動物模型7個月眼底出現(xiàn)典型的黃白色結(jié)晶沉積，而現(xiàn)有模型則至少需要12個月才能出現(xiàn)典型的結(jié)晶沉積，本模型在時間維度上有利于實驗研究的盡快開展；同時該動物模型的自然病程中12個月大小將出現(xiàn)外核層萎縮，對應(yīng)ERG中a與b波的熄滅，而現(xiàn)有模型在已隨訪的病程中并沒有出現(xiàn)外核層的萎縮，本模型更好地模擬BCD病人視功能的下降，更有利于BCD病理機制的探究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種制備Bietti結(jié)晶樣萎縮非人哺乳動物模型的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

Bietti結(jié)晶樣萎縮(Bietti crystalline dystrophy，BCD)是一種以常染色體隱性遺傳方式多見的遺傳性視網(wǎng)膜病變。其好發(fā)于亞裔人群，尤其在中國及日本。該病具有特征性的眼底表現(xiàn)：視網(wǎng)膜后極部黃白色結(jié)晶沉積伴隨視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)細胞萎縮、色素改變及脈絡(luò)膜萎縮。患者一般在20至40歲間起病，隨著夜盲、視力下降及視野缺陷的進展性改變，其生活將逐步受到影響。現(xiàn)有的BCD模型動物，均在模型細胞基因組中引入了外源基因，而外源基因?qū)游锘蚪M的影響是不可估量的。

因此，本領(lǐng)域急需一種不引入外源基因而有效的Bietti結(jié)晶樣萎縮非人哺乳動物模型，以在此基礎(chǔ)上探究該疾病的發(fā)病機制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)基于CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)建立CYP4V3基因敲除動物模型的方法，在CYP4V3基因所有轉(zhuǎn)錄本共有的第一個外顯子切除內(nèi)源性CYP4V3基因約430bp左右片段，從而達到基因敲除效果。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種制備Bietti結(jié)晶樣萎縮非人哺乳動物模型的方法，包括：

使用Crispr-Cas系統(tǒng)將所述動物CYP4V3基因敲除轉(zhuǎn)錄本第一個外顯子敲除；

其中所述Crispr-Cas系統(tǒng)包括sgRNA和Cas9酶，所述sgRNA包括對應(yīng)的靶位點序列為SEQ ID NO：1和2所示的sgRNA1和sgRNA2。

可選的，所述基因敲除的對象為受精卵。

可選的，所述Crispr-Cas系統(tǒng)以sgRNA和Cas9 mRNA的形式轉(zhuǎn)入所述受精卵。

可選的，所述Crispr-Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)入所述受精卵的方法為顯微注射。

可選的，所述方法還包括將處理后受精卵移植到假孕雌性動物體內(nèi)并產(chǎn)出F0代，將正確敲除CYP4V3基因的F0代動物與野生型動物交配獲得F1代雜合子動物。

可選的，所述方法還包括將所述F1代雜合子動物自交獲得F2代純合子動物。

可選的，所述非人哺乳動物為嚙齒類動物。

可選的，所述非人哺乳動物是小鼠(Mus musculus)。

可選的，所述方法不引入可穩(wěn)定表達的外源基因。

本發(fā)明還涉及如上所述方法得到的動物在鑒別和/或測試藥物中的用途；

所述藥物用于預(yù)防和/或治療的適應(yīng)癥為Bietti結(jié)晶樣萎縮和/或治療與Bietti結(jié)晶樣萎縮相關(guān)的并發(fā)癥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：