[發(fā)明專利]在體外克隆中分選核酸和多重制備物的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010793149.5
• 申請日: 2013-04-24
• 公開（公告）號: CN111876409A
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·雅各布森;M·J·戈德伯格;L-Y·A·昆;D·辛德勒;M·E·赫德森
• 申請（專利權(quán)）人: GEN9股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

方法和組合物涉及使用高通量測序進(jìn)行的高保真核酸的分選和克隆。具體地，可從包含具有正確和錯誤序列的多種核酸的集合中分選具有需要的預(yù)定序列的核酸分子。

相關(guān)申請

本申請要求2013年3月13日提交的美國臨時申請系列號61/851,774、2013年1月16日提交的美國臨時申請系列號61/848,961、2012年4月24日提交的美國臨時申請系列號61/637,750、2012年4月25日提交的美國臨時申請系列號61/638,187和2013年4月24日提交的題為“在體外克隆中分選核酸和多重制備物的方法”，代理人案卷號為127662-013702/US，快遞郵件標(biāo)簽號為EV 426282790 US的美國申請，其各自的全文通過引用納入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的方法和組合物涉及核酸組裝，并且具體涉及分選和克隆具有預(yù)定序列的核酸的方法。

背景

重組和合成核酸在研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)中有許多應(yīng)用。可以使用重組和合成核酸來表達(dá)和獲得大量的多肽，包含酶、抗體、生長因子、受體和其它可用于多種醫(yī)學(xué)、工業(yè)或農(nóng)業(yè)目的的多肽。也可以使用重組和合成核酸來產(chǎn)生遺傳修飾的生物體，包含修飾的細(xì)菌、酵母、哺乳動物、植物和其它生物體。遺傳修飾的生物體可以用于研究(例如，疾病的動物模型、理解生物過程的工具等)、工業(yè)(例如，作為蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主生物體、用于產(chǎn)生工業(yè)產(chǎn)物的生物反應(yīng)器、環(huán)境補(bǔ)救的工具、分離或修飾具有工業(yè)應(yīng)用的天然化合物等)、農(nóng)業(yè)(例如，具有增加的產(chǎn)率或增加的對疾病或環(huán)境壓力的抗性的修飾的作物)和用于其它應(yīng)用。重組和合成核酸也可以用作治療組合物(例如，用于修飾基因表達(dá)、用于基因治療等)或用作診斷工具(例如，病癥的探針等)。

已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于修飾存在的核酸(例如，天然存在的核酸)來產(chǎn)生重組核酸。例如，可以使用核酸擴(kuò)增、誘變、核酸酶消化、連接、克隆和其它技術(shù)來產(chǎn)生許多不同的重組核酸。經(jīng)常使用化學(xué)合成的多核苷酸作為用于核酸擴(kuò)增、誘變和克隆的引物或銜接子。

也發(fā)展了用于從頭核酸組裝的技術(shù)，其中制備(例如，化學(xué)合成)和組裝核酸來產(chǎn)生較長的感興趣的目標(biāo)核酸。例如，已經(jīng)開發(fā)了不同的多重組裝技術(shù)用于將寡核苷酸組裝成能用于研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和/或醫(yī)學(xué)的較大的合成核酸。然而，現(xiàn)有可用的組裝技術(shù)的一個限制是相對高的錯誤率。因此，需要高保真、低成本的組裝方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的方面涉及分選和克隆具有需要的或預(yù)定的序列的核酸分子的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括提供包含至少兩個目標(biāo)核酸分子群的核酸分子的一個或多個集合(各核酸分子群具有獨(dú)特的目標(biāo)核酸序列)，用非目標(biāo)寡核苷酸標(biāo)簽序列對核酸分子的5’末端和3’末端加標(biāo)簽，其中寡核苷酸標(biāo)簽序列包含獨(dú)特的核苷酸標(biāo)簽和引物區(qū)，稀釋帶標(biāo)簽的核酸分子，對帶標(biāo)簽的核酸分子進(jìn)行從兩端開始的測序反應(yīng)以得到成對末端讀取，并且按照它們相應(yīng)的獨(dú)特寡核苷酸標(biāo)簽對的相同性分選具有需要的序列的核酸分子。在另一些實(shí)施方式中，該方法包括提供包含至少兩個核酸分子群的核酸分子的一個或多個集合，各核酸分子群具有獨(dú)特的內(nèi)部核酸序列，以及在其5’末端和3’末端的寡核苷酸標(biāo)簽序列，其中寡核苷酸標(biāo)簽序列包含獨(dú)特的核苷酸標(biāo)簽和引物區(qū)，對帶標(biāo)簽的核酸分子進(jìn)行從兩端開始的測序反應(yīng)以得到成對末端讀取，并且按照它們相應(yīng)的獨(dú)特寡核苷酸標(biāo)簽對的相同性分選具有需要的序列的核酸分子。在一些實(shí)施方式中，各核酸分子群具有不同的需要的核酸序列。

在一些實(shí)施方式中，獨(dú)特的核苷酸標(biāo)簽可以連接到核酸分子的5’末端和3’末端。在其他實(shí)施方式中，可通過PCR在核酸分子的各末端連接獨(dú)特的寡核苷酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，獨(dú)特的核苷酸標(biāo)簽可包括完全簡并序列、部分簡并序列或非簡并序列。在一些實(shí)施方式中，獨(dú)特的寡核苷酸標(biāo)簽可包括編碼的條形碼。例如，獨(dú)特的核苷酸標(biāo)簽可包括以下的序列：CCWSWDHSHDBVHDNNNNMM或CCSWSWHDSDHVBDHNNNNMM。