[發明專利]利用無血清Vero細胞和狂犬病病毒rPV-2061制備狂犬病疫苗的工藝

有效

• 申請號: 202010792813.4
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111840535B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 梁智杰;黃林;崔利凱;陳坤
• 申請（專利權）人: 成都柏奧特克生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;A61K9/19;A61K47/42;A61K47/26;A61P31/14;C12N5/071;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述方法包括：

以美國標準菌種保藏中心（ATCC）編號為CCL-81.5的Vero細胞為病毒培養的宿主，接種狂犬病病毒rPV-2061株，培養，制備成狂犬病病毒疫苗；所述培養采用無血清培養基培養；

Vero細胞培養的工藝為：在生物反應器內無血清培養基灌流培養Vero細胞至0.6~0.7×10⁷cells/ml，開始病毒接種；所述生物反應器為固定床生物反應器；

病毒接種的工藝為：將狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接種到細胞，培養6h以上，開始使用無血清病毒維持液灌流培養；

所述無血清培養液的組成為：

Vero細胞無血清培養基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L；

所述無血清病毒維持液的組成為：

Vero細胞無血清培養基15.0~ 17.6 g/L，谷丙二肽2~4 mmol/L，果糖0.5~2.0 g/L，Tricine 0.5~2.0 g/L，碳酸氫鈉2~3g/L。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

（1）細胞培養：在生物反應器內無血清培養基灌流培養Vero細胞至0.6~0.7×10⁷cells/ml，開始病毒接種；

（2）病毒接種：將狂犬病病毒rPV-2061株按0.0025~0.01 MOI接種到細胞，培養6h以上，開始使用無血清病毒維持液灌流培養；

（3）收毒：病毒接種后，從第3天開始收獲病毒，得病毒收獲液；

（4）滅活：使用β-丙內酯滅活病毒；

（5）酶切：使用核酸酶對Vero細胞宿主DNA進行酶切；

（6）純化：分子篩層析純化病毒；

（7）配制原液：加入終濃度0.5~3%（m/v）人血白蛋白和終濃度3~5%（m/v）的麥芽糖作為穩定劑，即為原液。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）的β-丙內酯用量為病毒液的1/4000。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟（5）酶切條件為：45~180 U/ml的非限制性核酸內切酶，于5~37 ℃酶切24 小時以上。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟（6）的分子篩層析的填料是瓊脂糖凝膠4FF，流動相為pH 7.4~7.8的磷酸鹽緩沖液。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟（7）的人血白蛋白用量為3%（m/v）。

7.如權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟（7）的麥芽糖的用量為5%（m/v）。

8.如權利要求2~7任一所述的方法，其特征在于：所述方法還包括向原液中加入凍干保護劑進行冷凍干燥；

所述凍干保護劑為含有3~5%（m/v）麥芽糖、0.5~3%（m/v）人血白蛋白的磷酸緩沖鹽，緩沖液的pH為7.2~8.0。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于：

所述凍干保護劑含有5%（m/v）麥芽糖、3%（m/v）人血白蛋白。