[發(fā)明專利]利用無(wú)血清Vero細(xì)胞和狂犬病病毒rPV-2061制備狂犬病疫苗的工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010792813.4
• 申請(qǐng)日: 2020-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111840535B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁智杰;黃林;崔利凱;陳坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都柏奧特克生物科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/205
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/205;A61K9/19;A61K47/42;A61K47/26;A61P31/14;C12N5/071;C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明公開(kāi)了利用無(wú)血清Vero細(xì)胞和狂犬病病毒rPV?2061制備狂犬病疫苗的工藝。本發(fā)明的工藝包括：以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)編號(hào)為CCL?81.5的Vero細(xì)胞為病毒培養(yǎng)的宿主，接種狂犬病病毒rPV?2061株，培養(yǎng)，制備成狂犬病病毒疫苗。本發(fā)明的特定宿主、病毒組合，可在無(wú)血清培養(yǎng)中大量擴(kuò)增病毒；疫苗制備過(guò)程中，無(wú)需添加牛血清、胰酶、明膠和右旋糖酐，能達(dá)到極高的生產(chǎn)效率，且疫苗具有很高的效價(jià)和熱穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域。

背景技術(shù)

狂犬病是一種致死性疾病，一旦發(fā)病，其死亡率接近100％。主要表現(xiàn)為一種急性侵襲性病毒性腦炎，通過(guò)暴露于傳染性病毒的涎液或其它途徑傳播，疾病可以從動(dòng)物傳播給動(dòng)物，或者從動(dòng)物傳播給人類(lèi)。絕大部分人類(lèi)狂犬病的發(fā)生均源于犬咬傷，但貓、猴也是重要的病毒攜帶者。狂犬病疫苗是預(yù)防和治療狂犬病的最有效手段之一。

目前我國(guó)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)使用的人用狂犬病疫苗主要有Vero細(xì)胞、原代地鼠腎細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞3種細(xì)胞基質(zhì)；液體和凍干兩種成品劑型；1.0ml/劑和0.5ml/劑兩種規(guī)格，主要使用的毒種為aG、CTN-1V、PV-2061、PM株，其中PM株主要用于人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗的生產(chǎn)，aG、CTN-1V、PV-2061株主要用于Vero細(xì)胞狂犬病疫苗的生產(chǎn)。

目前上市銷(xiāo)售的凍干人用狂犬病疫苗通常在細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、病毒收獲或成品配制過(guò)程中添加牛血清、動(dòng)物源性胰酶、人血白蛋白、明膠及右旋糖酐等添加物。其中牛血清添加于細(xì)胞培養(yǎng)基，動(dòng)物源性胰酶用于將細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面分離，人血白蛋白經(jīng)常在β-丙內(nèi)酯滅活前添加到病毒維持液，明膠和右旋糖酐通常作為疫苗耐熱保護(hù)劑。但是，這些添加物會(huì)帶來(lái)安全問(wèn)題。牛血清、動(dòng)物源性胰酶可能攜帶多種病原體，人血白蛋白與滅活病毒用的β-丙內(nèi)酯反應(yīng)可引起1型(IgE)和3型(IgG-IgM)過(guò)敏反應(yīng)，明膠和右旋糖酐也容易引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。因此，減少或杜絕疫苗生產(chǎn)中牛血清、動(dòng)物源性胰酶、明膠、右旋糖酐的使用，避免人血白蛋白與β-丙內(nèi)酯反應(yīng)，可提升疫苗的安全性。

然而，為了保證生產(chǎn)的產(chǎn)量和效價(jià)，現(xiàn)有的狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝大多數(shù)仍在使用牛血清、動(dòng)物源性胰酶、人血白蛋白、明膠及右旋糖酐等添加劑(例如：專利申請(qǐng)CN102512686A、CN103690943A、CN106237339A等公開(kāi)的相關(guān)工藝)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中，有少數(shù)報(bào)道沒(méi)有添加前述添加物(對(duì)人血白蛋白而言，指未在β-丙內(nèi)酯處理前添加)的生產(chǎn)工藝。例如：孫燕等報(bào)道了一種無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備狂犬病病毒的工藝，采用無(wú)血清培養(yǎng)基VP-S FM并借助微載體cytodex-1培養(yǎng)Vero細(xì)胞，培養(yǎng)3天后按MOI＝0.02接種狂犬病病毒CTN-1V株，收獲病毒液的平均病毒滴度為6.5lgFFU/ml，與含血清培養(yǎng)基的工藝相當(dāng)；平均病毒效力(效價(jià))為6.77IU/ml，高于含血清培養(yǎng)基的工藝(無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備狂犬病病毒工藝的建立，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016年10月，第29卷第10期)。專利申請(qǐng)CN104826101A公開(kāi)了一種凍干人用狂犬病疫苗制備方法，該方法在14L固定床式生物反應(yīng)器(BIOFLO CELLIGEN 310)內(nèi)，將Vero細(xì)胞粘附在片狀載體上培養(yǎng)，完成細(xì)胞培養(yǎng)、病毒接種、連續(xù)收毒等工作，滅活病毒、純化后，加入終濃度1％的人血白蛋白，形成原液，在不含明膠、人血白蛋白和右旋糖酐的凍干保護(hù)劑(含海藻糖60～90g/L、谷氨酸鈉6～14g/L、尿素3～6g/L、L-精氨酸2～3g/L、199培養(yǎng)基10g/L)保護(hù)下凍干可得到效價(jià)5IU/劑(每劑0.5ml)的疫苗。可以看出，這些生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)品效價(jià)偏低的問(wèn)題。

綜上，繼續(xù)對(duì)現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)，在不添加無(wú)牛血清、動(dòng)物源性胰酶、人血白蛋白、明膠及右旋糖酐的情況下，高效制備得到高效價(jià)的狂犬病疫苗，具有顯著的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的問(wèn)題是：提供一種新的制備狂犬病疫苗的工藝。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種制備狂犬病疫苗的工藝，所述工藝包括：