[發明專利]表皮干細胞向胰腺細胞分化的改進方法

有效

• 申請號: 202010792164.8
• 申請日: 2018-09-03
• 公開（公告）號: CN111848743B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 楊駿;張勇
• 申請（專利權）人: 吉林省匯融生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 周明新

本發明提供了一種表皮干細胞向胰腺細胞分化的改進方法，基于表皮干細胞作為基礎，通過添加活性誘導肽，使得細胞分化成為胰腺細胞，并且分化時間較短，表皮干細胞來源寬泛，成本低廉，制備簡便，具有極好的市場應用前景。

技術領域

本發明涉及非胚胎多能干細胞領域，具體地涉及非胚胎多能干細胞提供胰腺細胞的用途以及產生和使用它們的方法。

背景技術

胚胎干細胞是一種全能干細胞，在適當的條件下它可分化為體內任何組織的體細胞。Lumelsky等人報道，通過體外五步誘導的方法，可將胚胎干細胞誘導分化為胰島β細胞，而Shi等在他們的研究中報道，他們通過三步法可將胚胎干細胞誘導成為胰島β細胞，并且這些細胞移植入糖尿病老鼠體內后可使動物的體重增加，存活時間延長，血糖下降。但是，由于胚胎干細胞存在目前尚無法解決的致瘤性問題，因此目前離臨床運用還有一定的距離。

對于胰腺腺管來源的干細胞，Bonner-Weir等在他們的研究報告中報道，在胰腺的腺管中存在一種CK19陽性的干細胞，此種細胞在有KGF和Matrigel存在的情況下，可大量擴增并分化為胰島β細胞。對于胰島來源的干細胞，Zulewski等報道，他們從正常胰腺的胰島團中分離培養出了一種表達神經干細胞標志nestin蛋白(巢蛋白)的細胞，此種細胞可在體外大量擴增，并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化為胰腺內分泌細胞。

Huangamp；Tang，2003；Zulewski et al.，2001文章中披露的胰腺干細胞為胰島來源的成體干細胞。Zulewski等所用的組織為正常的人或鼠的胰腺組織。由于在實踐中難以獲得足夠數量的正常的人胰腺組織，所以將該技術應用于臨床時仍會面臨來源不足的問題。

在現有技術中，還有其他的方式來獲得胰腺細胞。比如CN101310012A中提供將非胚胎多能干細胞向胰腺譜系分化的方法。本發明進一步提供非胚胎多能干細胞及其衍生的子代，從而為受試者提供胰腺細胞。所述方法包含將表達Ngn3的細胞與煙酰胺或exendiM兩者中的一種或與這兩者相接觸以產生表達胰島素的細胞，所述表達Ngn3的細胞已經通過下述過程制備：(1)將表達Oct-4和端粒酶且可以分化成外胚層、內胚層和中胚層細胞類型的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑和一種第二試劑相接觸以產生Pdx-I表達升高的細胞，其中所述第一試劑是激活素A，所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性；以及(2)將Pdx-I表達升高的細胞與EGF和/或HGF相接觸，以產生Ngn3表達升高的細胞。但是該方法制備復雜，成功率還有待進一步的提高。

CN1847394A中公開了一種誘導胚胎干細胞向胰腺細胞分化的方法，該方法是依次利用Activin A和順式視黃酸處理由胚胎干細胞形成的胚胎小體，使其分化得到胰腺細胞。但是該方法中使用了胚胎干細胞，由于胚胎干細胞來源有限，并不適應大規模推廣使用，市場應用價值不高。

因此，需要解決胰島移植中胰腺組織來源不足的問題，還需要尋找一種來源廣泛的干細胞，并且采用簡單誘導方式即可獲得胰腺細胞來滿足社會的需求，從而造福人類。

發明內容

本發明提供了與現有技術方案相比，將來源更為簡便的表皮干細胞以更短的時間量(7天)和顯著增加的產率(高達97％產率)分化成確定的胰腺細胞的改進方法。

本文提供了使表皮干細胞分化為的胰腺細胞的方法，該方法包括步驟：

第一步，將表皮干細胞放至1％Matrigel鋪被的培養皿中按照如下方法用活性刺激肽誘導：