[發明專利]一種檢測covid-2019冠狀病毒的RNA探針及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202010790666.7
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111748654B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 謝華平;袁春燕;陳湘定;謝繽靈;胡昱瑤;孫魯寧;印遇龍
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6841;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 趙徐平

本發明公開了一種檢測covid?2019冠狀病毒的RNA探針及其制備方法與應用，屬于核酸雜交技術領域。RNA探針核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，制備過程包括：設計引物、構建重組質粒、PCR擴增和體外轉錄；本發明將制備得到的探針應用于檢測covid?2019中，能夠在單細胞水平檢測covid?2019病毒核酸，提高了檢測的靈敏度、準確性和特異性。

技術領域

本發明涉及核酸雜交技術領域，具體涉及一種檢測covid-2019冠狀病毒的RNA探針及其制備方法與應用。

背景技術

2019新型冠狀病毒(covid-2019)，其潛伏期長、侵染力強，主要攻擊動物體的肺部，引起肺部感染。

目前鑒定新型冠狀病毒有熒光定量PCR法和抗體檢測方法，其中核酸檢測方法為檢驗病毒方法的金標準，但是現有方法中仍存在諸多問題，諸如：

(1)熒光定量PCR能夠鑒定疑似患者體內的核酸，該方法需要提取細胞中的RNA，隨后進行反轉錄，然后進行PCR鑒定，在這些實驗操作中RNA的損失比較多，如果疑似患者處于感染早期或者體內本身含有病毒量比較少，很容易導致RNA在提取過程中丟失，導致假陰性結果出現。

(2)由于新型冠狀病毒是RNA病毒，RNA病毒變異速度快，并且該變異能夠不斷進行累積，熒光定量PCR實驗對核酸序列要求比較高，尤其是在PCR引物覆蓋的區域要求比較苛刻，如果該區域核酸發生突變，導致PCR擴增效率降低甚至不能擴增出來，從而產生假陰性結果。

(3)熒光定量PCR實驗未經過測序鑒定，有可能擴增出非目的片段，出現假陽性現象，造成了檢測結果的不準確。

RNA探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子，其是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高，可以檢測到單個細胞中是否含有目的RNA，因此，可以有效檢測出待測目的片段。

因此，如何提供一種可以有效檢測covid-2019的探針，并將其應用于檢測covid-2019中是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種檢測covid-2019冠狀病毒的RNA探針及其制備方法與應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測新型冠狀病毒covid-2019的RNA探針，RNA探針的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本發明還提供了上述的RNA探針的制備方法，步驟如下：

1)引物設計與合成：根據covid-2019待測區域核苷酸序列設計合成上游引物和下游引物；

2)構建重組載體：將covid-2019待測區域的核苷酸序列插入至表達載體中，得到帶有covid-2019待測區域核苷酸序列的重組載體；

3)PCR擴增：利用步驟1)合成的上游引物和下游引物PCR擴增重組載體，所得PCR擴增產物純化后得到covid-2019待測區DNA片段；

4)體外轉錄：以covid-2019待測區DNA片段為模板進行體外轉錄，合成反義RNA探針。