[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)covid-2019冠狀病毒的RNA探針及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010790666.7
• 申請(qǐng)日: 2020-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111748654B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝華平;袁春燕;陳湘定;謝繽靈;胡昱瑤;孫魯寧;印遇龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6841;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 趙徐平

1.一種檢測(cè)新型冠狀病毒covid-2019的RNA探針，其特征在于，所述RNA探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.權(quán)利要求1所述的RNA探針的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)covid-2019待測(cè)區(qū)域核苷酸序列設(shè)計(jì)合成上游引物和下游引物；

2)構(gòu)建重組載體：將所述covid-2019待測(cè)區(qū)域的核苷酸序列插入至表達(dá)載體中，得到帶有covid-2019待測(cè)區(qū)域核苷酸序列的重組載體；

3)PCR擴(kuò)增：利用步驟1)合成的上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增所述重組載體，所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后得到covid-2019待測(cè)區(qū)DNA片段；

4)體外轉(zhuǎn)錄：以所述covid-2019待測(cè)區(qū)DNA片段為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成反義RNA探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述上游引物為COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物為COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述covid-2019待測(cè)區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述表達(dá)載體為pcDNA3.1-myc-HisA載體，所述重組載體為pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。

5.權(quán)利要求1所述的RNA探針在制備檢測(cè)新型冠狀病毒covid-2019的試劑盒或試劑中的應(yīng)用。

6.一種非診斷治療目的檢測(cè)新型冠狀病毒covid-2019的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)雜交預(yù)處理：取待測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理；

(2)預(yù)雜交：將預(yù)雜交液加入到處理后的樣本中，進(jìn)行孵育；

(3)雜交：除去預(yù)雜交液，將待測(cè)樣本和雜交液混合，進(jìn)行孵育；

(4)雜交后處理：除去雜交液，將孵育后的RNA探針回收，漂洗待測(cè)樣本后和阻斷溶液混合，孵育得到雜交樣本；

(5)顯色、照相：將雜交樣本加入到含有終體積分?jǐn)?shù)為1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT溶液清洗，然后以檢測(cè)緩沖液清洗；加入AP底物染色緩沖液進(jìn)行室溫孵育，包裹避光，當(dāng)待測(cè)樣本著色出現(xiàn)后，用PBS溶液清洗，顯微鏡觀察，照相；

步驟(4)所述RNA探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟1)所述雜交預(yù)處理是指將待測(cè)樣品經(jīng)蛋白酶K消化后，經(jīng)PBST溶液漂洗后經(jīng)多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)所述預(yù)雜交液用量200ul由以下成分構(gòu)成：體積比50％的甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、pH值8.0的5mM EDTA、50μg/mL核糖體RNA、1.84％V/V 1M檸檬酸和0.1％V/VTween。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)所述雜交液用量200μL，由所述預(yù)雜交液用量200ul和所述檢測(cè)新型冠狀病毒covid-2019的RNA探針混合構(gòu)成，其中所述RNA探針終濃度為2ng/μL。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟5)所述AP底物染色緩沖液包括4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP和4μL/mL左旋咪唑；所述檢測(cè)緩沖液為每50mL溶液包含以下成分：100mM NaCl、50mM MgCl₂、100mM三羥甲基氨基甲烷T(mén)ris-HCl、1mM 0.1％Tween-20和1mM左旋咪唑。