[發明專利]牛乳鐵蛋白雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條、制備方法、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202010788382.4
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN111896749A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 邵儷黎;趙啟皓;許叢文;王宏;陳宗倫;蔡菁華;戴仙兵;黃佳娟;鐘文茵
• 申請（專利權）人: 杭州都林生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 杭州凱知專利代理事務所(普通合伙) 33267
• 代理人: 金國棟

1.一種牛乳鐵蛋白雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條，其特征是，包括底板、以及重疊設置在底板上的吸水墊、層析膜、結合物釋放墊和樣品墊，結合物釋放墊上包被有膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物，層析膜上設有一條檢測線和一條質控線，所述檢測線包被有抗牛乳鐵蛋白抗體b，所述質控線包被有羊抗鼠IgG。

2.根據權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征是，層析膜上的檢測線包被有濃度為0.5-2mg/mL的抗牛乳鐵蛋白抗體b，層析膜上的質控線包被有濃度為0.5-1mg/mL的羊抗鼠IgG。

3.根據權利要求1所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征是，所述抗牛乳鐵蛋白抗體a和抗牛乳鐵蛋白抗體b同為抗牛乳鐵蛋白單克隆抗體或抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體或抗牛乳鐵蛋白重組抗體中的一種。

4.根據權利要求3所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征是，所述抗牛乳鐵蛋白抗體a和抗牛乳鐵蛋白抗體b同為抗牛乳鐵蛋白單克隆抗體。

5.一種膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的制備方法，其特征是，所述方法包括以下步驟：

取10mL燒制完成的膠體金溶液，用0.1M K₂CO₃溶液調節pH至7.5，磁力攪拌下逐滴加入1mL濃度為110μg/mL的牛乳鐵蛋白抗體溶液，混勻，靜置1h；

靜置完成后的溶液中逐滴加入1.3mL含10％BSA和1％PEG的硼酸緩沖液，混勻，靜置1h，13500r/min離心30min，棄上清，用硼酸緩沖液復溶后重復離心一次，最后沉淀用1％BSA，5％蔗糖定容至1mL，即膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的濃縮液。

6.根據權利要求5所述的膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的制備方法，其特征是，所述膠體金為氯金酸在檸檬酸鈉還原下燒制獲得的20-60nm的膠體金顆粒。

7.根據權利要求6所述的膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的制備方法，其特征是，所述膠體金顆粒為20-60nm。

8.牛乳鐵蛋白雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征是，所述方法包括以下步驟：

步驟1，制備樣品墊：所述樣品墊采用玻璃纖維膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液處理玻璃纖維膜1h后，烘干制成樣品墊；

步驟2，制備結合物釋放墊：所述結合物釋放墊采用玻璃纖維膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液預處理玻璃纖維膜1h后烘干備用；采用權利要求7或8或9任意一項方法所制備的膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的濃縮液稀釋10-20倍后以3μL/cm均勻噴涂在預處理的玻璃纖維膜上，得到包被膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物的結合物釋放墊，37℃干燥24h后，密封備用；

結合物釋放墊上包被有膠體金標記的牛乳鐵蛋白單克隆抗體a，濃度為0.5-1mg/mL，通過噴金劃膜儀噴涂干燥后得到；

步驟3，制備層析膜：所述層析膜采用硝酸纖維膜，在層析膜上設置一條檢測線和一條質控線，所述檢測線包被有1mg/mL的抗牛乳鐵蛋白單克隆抗體b，所述質控線包被有0.5mg/mL的羊抗鼠二抗IgG；

步驟4，組裝試紙條：樣品墊、結合物釋放墊、層析膜依次壓覆在PVC底板上，并且在邊緣重疊2～3mm；吸水墊壓覆在層析膜的另一端且邊緣重疊2～3mm，得到組裝的定量檢測牛乳免疫球蛋白雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條。

9.一種定量檢測牛乳免疫球蛋白雙抗體夾心膠體金免疫層析試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括權利要求1或2或3或4或5任一一項所述的膠體金免疫層析試紙條和金標免疫分析儀組成。

10.一種檢測方法，其特征是，所述方法包括以下步驟：

將膠體金免疫層析試紙平放；吸取一系列含牛乳鐵蛋白濃度梯度的樣品，每個濃度梯度的樣品取4滴分別滴加到樣品墊上；

所述樣品經過層析作用與結合物釋放墊上的膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體a復合物特異性結合；

待樣品中的牛乳鐵蛋白與膠體金標記的牛乳鐵蛋白抗體復合物進一步經過檢測線和質控線；

靜置10-15min；

通過金標免疫分析儀對檢測線和質控線的顯色強度進行測量，來對樣品中的牛乳鐵蛋白含量進行精確定量。