[發(fā)明專利]一種新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010787913.8
• 申請(qǐng)日: 2020-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111849947A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮翠;任立世;張毓宸;焦思明;王穎;程功;孫明;杜昱光
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中科榮信（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/80
• 分類號(hào): C12N9/80;C12N15/55;C12N15/81;C12P19/26;C12R1/84
• 代理公司: 上海碩力知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31251
• 代理人: 郭桂峰

本發(fā)明公開(kāi)了一種新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性，優(yōu)化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用全基因合成方法獲得新型隱球菌的幾丁質(zhì)脫乙酰酶編碼基因序列。進(jìn)一步利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)所述優(yōu)化的幾丁質(zhì)脫乙酰酶編碼基因進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得幾丁質(zhì)脫乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明獲得的幾丁質(zhì)脫乙酰酶可對(duì)幾丁質(zhì)、殼聚糖及殼寡糖中的乙酰基進(jìn)行脫除，從而獲得特定結(jié)構(gòu)的殼聚糖或殼寡糖。這些特定結(jié)構(gòu)的殼聚糖或殼寡糖可具有新的或更高的生物活性。因此，該新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶及其脫乙酰產(chǎn)物均具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于殼聚糖或殼寡糖制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)幾丁質(zhì)脫乙酰酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

殼聚糖具有抗菌及激發(fā)動(dòng)植物免疫等一系列生物活性。目前，主要通過(guò)化學(xué)法使用強(qiáng)堿對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行化學(xué)脫乙酰獲得，容易造成環(huán)境污染。直接使用幾丁質(zhì)脫乙酰酶對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行脫乙酰有可能獲得乙酰基位點(diǎn)分布可控的殼聚糖，且對(duì)環(huán)境友好。殼寡糖是甲殼素或者其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖經(jīng)物理、化學(xué)或酶學(xué)等方法降解產(chǎn)生的寡聚物，由氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)或者二者的組合通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成，通常聚合度(degree of polymerization，DP)20。殼寡糖具有抗炎、抗腫瘤及激活植物免疫等一系列生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)，如DP及脫乙酰度(Degree of deacetylation,DDA)甚至乙酰基在寡糖鏈上的分布等密切相關(guān)。因此，制備結(jié)構(gòu)可控的殼寡糖是該領(lǐng)域多功能及高活性新產(chǎn)品研發(fā)的新方向。利用不同底物識(shí)別類型的幾丁質(zhì)脫乙酰酶對(duì)幾丁質(zhì)、殼聚糖或殼寡糖進(jìn)行脫乙酰，可以獲得特定脫乙酰度及乙酰基位點(diǎn)分布的殼聚糖或殼寡糖，從而得到可能具有更高或更新生物活性的新產(chǎn)品。目前，尚缺乏工業(yè)用的幾丁質(zhì)脫乙酰酶制劑，限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶及其制備方法和應(yīng)用，旨在提供一種經(jīng)濟(jì)高效的幾丁質(zhì)脫乙酰酶。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：

一種新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶，所述新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的氨基酸序列選自以下其中一種：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加修飾且具有相同功能的氨基酸序列；

(3)與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的氨基酸序列選自與SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更優(yōu)選地，具有95％以上的同源性。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的氨基酸序列選自與SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更優(yōu)選地，具有99％以上的同源性。

本發(fā)明還提供一種新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因，其編碼上述的新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述新型隱球菌幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，所述表達(dá)載體為pGBG1，表達(dá)載體pGBG1通過(guò)如下方式獲得：