[發明專利]應用MLPA檢測細胞遺傳學異常的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010787725.5
• 申請日: 2020-08-07
• 公開（公告）號: CN112553310A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 安剛;邱錄貴;閻禹廷;于珍;秦小琪;藏美蓉
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 馬云華

本發明提供了應用MLPA檢測細胞遺傳學異常的方法及試劑盒，屬于細胞遺傳學異常檢測技術領域，所述方法包括以下步驟：分別分離細胞檢測樣本和細胞參照樣本中的單個核細胞從中分選獲得CD138陽性漿細胞；提取所述CD138陽性漿細胞的基因組DNA；將所述基因組DNA變性后，進行MLPA反應、連接和PCR擴增獲得PCR擴增產物；對所述PCR擴增產物進行毛細管電泳，比較細胞檢測樣本和細胞參照樣本的毛細管電泳結果分析細胞遺傳學異常。本發明所述方法可以同時檢測多達100個基因的外顯子情況，包括小拷貝數的缺失或重復；并且所述試劑盒檢測快速、簡單、價格便宜、特異性高。

技術領域

本發明屬于細胞遺傳學異常檢測技術領域，尤其涉及應用MLPA檢測細胞遺傳學異常的方法及試劑盒。

背景技術

多發性骨髓瘤(MM)是一種具有遺傳學異質性的漿細胞惡性腫瘤，發病率占惡性血液病的10％～15％，好發于中老年人。主要表現為骨痛、貧血、持續感染、高鈣血癥、腎功能異常等。MM生存期從數月到15年以上不等，雖然近年來出現了一些新藥使患者預后顯著改善，但仍然不可治愈。因此建立準確的預后判斷體系對制定精準治療方案有重要的臨床意義。

近年研究發現幾乎所有的MM患者均存在細胞遺傳學異常，遺傳學異常是影響MM預后最重要的因素。對于細胞遺傳學異常的檢測方法主要包括傳統染色體檢測法、熒光原位雜交法、比較基因組雜交法和全基因組測序法。

傳統染色體檢測法基于顯帶技術，是將處理后的染色體染色，每個染色體都有特定帶紋，帶紋的變化表示該染色體的改變。其可以檢測染色體數目及結構異常，對判定疾病危險度有重要臨床意義。傳統染色體檢測必須在細胞中期分裂條件下進行，只能檢出1/3患者的細胞遺傳學異常，且由于結果判定依賴于檢驗者的經驗，主觀性大，在應用中受到了很大限制。

熒光原位雜交(FISH)的基本原理是將寡聚核苷酸探針與變性后核酸按照堿基互補配對原則進行雜交，經處理后形成靶DNA與核酸探針的雜交體，在熒光顯微鏡下顯影，即可對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。該技術不需要中期分裂象，檢出率高，結果準確，檢驗快速，操作安全，成為傳統染色體檢測法的一個有益補充。但其局限性是不能檢測完整的染色體變異，僅能辨識特異性探針結合區域。

比較基因組雜交(CGH)是在1992年后發展起來的分子細胞遺傳學技術，其基本原理是用不同的熒光染料通過缺口平移法分別標記腫瘤組織和正常細胞或組織的DNA，制成探針，并與健康人的間期染色體進行共雜交，以在染色體上顯示腫瘤與健康對照的熒光強度的不同來反映整個腫瘤基因組DNA表達情況的變化，再借助于圖像分析技術可對染色體拷貝數量的變化進行定量研究。該法所需DNA樣本量較少，適用于外周血、培養細胞、新鮮組織樣本、存檔組織研究及DNA量少而經聚合酶鏈反應(PCR)擴增樣本的研究。但CGH技術所能檢測到的最小的DNA擴增或丟失是在3～5Mb，故對于低水平的DNA擴增和小片段的丟失會漏檢；且價格較昂貴，有一定技術難度，目前主要應用于臨床試驗或科研，尚未普遍應用于臨床。

全基因組測序即對一種生物的基因組的全部基因進行測序，測定其DNA的堿基序列。該方法是在1986年首次被Renato Dulbecco提出，他認為如果能夠知道所有人類基因序列，對癌癥研究將有很大幫助。但該方法耗時、耗力、耗財，目前尚未用于臨床。

隨著檢測技術的不斷進步，遺傳學異常的檢出率逐漸提高。雖然目前FISH是細胞遺傳學異常檢測的標準方法，但仍有缺陷，并不能獲得完整的染色體異常信息，檢出率未達到遺傳學異常的發生率，并且研究者水平參差不一，使得各個遺傳學異常的預后意義仍存在差異。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供應用MLPA檢測細胞遺傳學異常的方法及試劑盒；本發明所述方法可以同時檢測多達100個基因的外顯子情況，包括小拷貝數的缺失或重復。并且所述試劑盒檢測快速、簡單、價格便宜、特異性高，對細胞遺傳學檢測有臨床推廣潛力。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：