[發(fā)明專利]一種胰高血糖素樣肽-1類似物單體及其二聚體和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010782404.6
• 申請日: 2020-08-10
• 公開（公告）號: CN111944061B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 桑延霞;李占潮;張軍軍
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東藥科大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/26;A61K47/64;A61P3/10;A61P3/04;A61P3/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

1.一種胰高血糖素樣肽-1類似物單體，其特征是：所述單體的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述單體由串聯(lián)的突變胰高血糖素樣肽-1 與人白蛋白結(jié)合域ABD融合后獲得的融合蛋白，所述單體命名為(mGLP-1)₂-ABD，所述單體 (mGLP-1)₂-ABD組成由以下通式表示：

6His—Linker-1—mGLP-1—Linker-2—mGLP-1—Linker-2—ABD—Linker-2—Cys；

其中：

6His為組氨酸純化標(biāo)簽，其氨基酸序列為HisHisHisHisHisHis；

Linker-1為連接肽-1，是thrombin和DPP-4酶的水解位點，其氨基酸序列為LVPRTP；

mGLP-1為GLP-1（7-37）第2位Ala被Gly取代得到的突變體，其氨基酸序列為：

HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG；

Linker-2為連接肽-2，其氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGSA；

ABD為人血清白蛋白結(jié)合肽，其氨基酸序列為：

LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP；

Cys為半胱氨酸。

2.編碼權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1類似物單體的基因，其特征是：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體，其特征是：所述二聚體由權(quán)利要求1所述的單體(mGLP-1)₂-ABD通過二硫鍵連接形成，所述胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體命名為[(mGLP-1)₂-ABD]₂。

4.權(quán)利要求3所述胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體的制備方法，其特征是包括以下步驟：

（1）通過SOE-PCR擴增獲得胰高血糖素樣肽-1類似物單體(mGLP-1)₂-ABD的基因，將單體基因和表達載體分別用兩種限制性內(nèi)切酶酶解，再用連接酶連接，構(gòu)成含有胰高血糖素樣肽-1類似物單體核苷酸序列的重組表達載體；

（2）將步驟（1）中序列正確的重組表達載體轉(zhuǎn)化至表達宿主細胞進行誘導(dǎo)表達；

（3）純化胰高血糖素樣肽-1類似物單體(mGLP-1)₂-ABD；

（4）氧化胰高血糖素樣肽-1類似物單體(mGLP-1)₂-ABD，獲得以二硫鍵連接的胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體[(mGLP-1)₂-ABD]₂。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體的制備方法，其特征是：步驟（2）中所述的表達宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體的制備方法，其特征是：步驟（3）中的純化包括：（3.1）離心收集菌體，超聲裂解菌體釋放(mGLP-1)₂-ABD融合蛋白；（3.2）Ni-NTA親和層析純化，去除宿主菌的背景蛋白；（3.3）用C8層析柱對胰高血糖素樣肽-1類似物單體(mGLP-1)₂-ABD的粗產(chǎn)物進行除鹽及純化。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體的制備方法，其特征是：步驟（4）中利用雙氧水或DMSO氧化胰高血糖素樣肽-1類似物單體(mGLP-1)₂-ABD形成胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體[(mGLP-1)₂-ABD]₂。

8.權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1類似物單體及其藥學(xué)上可接受的鹽或權(quán)利要求3所述的胰高血糖素樣肽-1類似物二聚體及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備具有預(yù)防和治療非胰島素依賴性糖尿病及其并發(fā)癥功效的藥物中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述非胰島素依賴型糖尿病及其并發(fā)癥為II型糖尿病、糖耐量受損、代謝綜合征。