[發明專利]PCR檢測中的消化探針及其試劑盒

在審

• 申請號: 202010782390.8
• 申請日: 2020-08-06
• 公開（公告）號: CN114058685A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 陳瑩;張奇;張穎;張曄
• 申請（專利權）人: 北京閱微基因技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及PCR檢測中的消化探針及其試劑盒。消化探針，其結構為：探針5’端??探針中部??探針3’端，本發明通過調整消化探針結構和引入堿基修飾，使得消化探針5’端結合能力較弱，3’端結合能力較強，從而在保證對消化目的片段消化效率的前提下，強化消化特異性，使得目的片段對應檢測信號得到更有效的富集，最終實現大幅提升檢測靈敏度，可以實現液體活檢。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域中的臨床分子診斷檢測技術。本發明涉及PCR檢測中的消化探針及試劑盒，特別是微衛星不穩定狀態檢測中野生型目標片斷消化探針及其應用，可以提高微衛星不穩定(MSI)檢測靈敏度，特別是可以應用于液體活檢的MSI檢測方法。

背景技術

微衛星序列是指核心序列為1～6個堿基的短串聯重復結構，這些重復序列分布在整個人類基因組中。在DNA復制時插入或缺失突變引起的微衛星序列長度改變的現象被稱之為微衛星不穩定(Microsatellite Instability，MSI)。

微衛星不穩定(MSI)現象在很多實體瘤中都存在。MSI發生率最高的腫瘤類型包括子宮內膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、結直腸癌(10-15％)、甲狀腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壺腹癌、宮頸癌、食管腺癌、軟組織瘤、頭頸癌、腎癌等中發生率也有一定比例(2-10％)。其中對結直腸癌MSI的研究開展最早、最為深入，而且很多MSI相關理論和應用已經得到廣泛認可，被NCCN指南、ASCO指南等推薦應用于臨床。

以研究MSI相對較早和較為深入的結直腸癌為例：有大量證據表明，dMMR/MSI-H是II期結直腸癌患者預后良好的一個標志物，對于具有dMMR/MSI-H腫瘤的II期結直腸癌患者，3/4級分化(低分化)不再認為是高危因素；對于具有dMMR/MSI-H的II期結直腸癌患者，給予5-FU輔助化療不能帶來生存獲益，反而會對患者不利。因此，II期CRC患者是否需要輔助化療，需要綜合考慮臨床高危因素和MSI狀態；隨著免疫治療相關研究的深入以及多款PD1/PD-L1藥物上市，MSI檢測作為預測PD1/PD-L1藥物適用性主要指標之一，其檢測需求更加重要和廣泛。

檢測MSI結直腸癌的方法主要有檢測錯配修復蛋白缺陷的免疫組織化學法和基于MSI檢測的PCR方法。免疫組織化學檢測4種主要的錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，通過檢測錯配修復蛋白缺失情況反應腫瘤的MSI狀態。免疫組織化學法易受組織固定、染色條件等的影響而出現假陽性或假陰性結果，而且操作相對復雜、檢測周期較長。

PCR方法通過擴增特定微衛星序列，根據正常組織與腫瘤組織微衛星序列長度的差異判斷腫瘤MSI狀態。美國國立癌癥研究所(NCI)于1996和2004年頒布了Bethesda指南及該指南修訂版。該指南對遺傳性非息肉結直腸癌及散發性結直腸癌的MSI檢測，推薦檢測體系包括五個位點，其中兩個位點為單堿基重復，三個為雙堿基重復。同時，Bethesda指南確定MSI的標準為：30％的位點不穩定為MSI-H，10％～30％為MSI-L，10％為MSS。這一判定標準得到大多數臨床和科研工作者認可。由于雙堿基重復位點多態性、峰型判定困難以及雙堿基重復位點常引起MSI-L檢測結果，所以很多研究者認為雙堿基重復位點不適合用于檢測MSI，應該使用更多的單堿基重復位點。目前已有多款檢測單堿基重復位點的體系或產品被廣泛應用于科研與臨床領域，如本公司基于專利CN201810126825.6的檢測試劑盒，作為首款獲得國家藥品監督管理局批準的MSI檢測產品，可用于臨床檢測。

液體活檢一般指通過體液樣本(如外周血、尿液、腦脊液等)而非傳統組織樣本進行檢測的方法，主要檢測對象包括循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環腫瘤細胞(CTC)和腫瘤特異抗體等。液體活檢具有快速簡便、無創、樣本量充足、可連續性監測等優點，目前已成為個體化精準治療研究和應用的熱點之一。